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  • 如何提取和逆转录circRNA?

    常用细胞组织等样品提取total RNA,其中包含mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA等所有的RNA种类,暂没有方法直接提取circRNA。但可以对total RNA进行RNase R消化处理,以使circRNA得到富集。
    对total RNA或RNase R处理的RNA进行逆转录,应使用随机引物,不能使用oligo(dT),因为circRNA没有polyA尾。逆转录过程中circRNA模板是呈环形的,逆转录的cDNA第一链是线性的单链DNA,后续的PCR产物是线性的双链DNA。

  • 怎么做circRNA过表达实验?

    CircRNA的形成和线性RNA不同,因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体(如pcDNA3.1)来进行。
    已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列(RCMs,如Alu元件)或与能调控circRNA生成的蛋白(如QKI)的结合位点,因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列,质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链,再依靠长下游的反向互补配对促使成环。
    具体实验中构建载体时可以在circRNA的侧翼各延伸1kb(一般会包含Alu或重复序列),使用真核表达载体构建一个上游侧翼1kb+circRNA+下游侧翼1kb的载体,一般都可以成功地过表达构建的circRNA。另外也可以使用商业化有通用成环框架的circRNA表达载体(如pLCDH-ciR)来构建,只需要连接circRNA序列进入载体即可。

  • 如何知道circRNA是否可以翻译蛋白?

    考虑感兴趣的circRNA是否能翻译蛋白,可先以ORF Finder分析序列基础,预测是否有合适的ORF。有一个跨越junction的ORF是最理想的,序列内部不跨越junction的ORF可能和mRNA一样,没办法特异研究circRNA。也可以参考circRNADb数据库,已收录的circRNA都有相应的ORF注释信息。
    有了序列基础后也要考虑circRNA翻译的机制,如考虑IRES介导可以在circRNADb参考相应的预测信息,或者使用其他工具预测IRES元件,也可以考虑m6A介导的翻译。
    预测ORF有了序列基础,再分析IRES和m6A或其他机制介导翻译,下一步就可以进行实验验证了。实验可以分为两部分,一是用特异性的抗体或引入标签抗体进行检测,验证是否能检测到预测的蛋白(多肽),二是验证IRES或m6A介导的翻译机制。

  • circRNA过表达成功标准是什么?

    载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。1.qPCR检测有过表达倍数,质粒瞬转效率高,基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上;2.使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带,PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。

  • RNA结合蛋白结合的非特异性高的可能原因及解决方案?

    可能原因:1.缓冲环境没有优化;2.缓冲环境严谨性低;3.样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。
    解决方法:1.优化孵育时间温度盐浓度等条件;2.使用严谨性高的缓冲体系;3.调低RNA探针和样品的比例;4.提高裂解液的量。

  • RNA pull down银染后,条带背景深是什么原因?

    背景深需考虑是不是SDS-PAGE染色时间过长或者抗体的质量问题,多克隆抗体经常会出现这种情况,最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了,针对这一点,有以下解决措施:
    1.优化孵育时间、温度、盐浓度等条件;2.优化缓冲体系,使用严谨性高的缓冲体系;3.提高裂解液的质量。

  • 怎么区分IP和CoIP?

    IP是在已知一种蛋白质的抗体情况下,直接用这种抗体将目标蛋白质提取出来,是一种提纯蛋白质的方法。
    免疫共沉淀(CoIP)主要用于检测蛋白质与蛋白质之间连接作用,如你想检测蛋白质A与蛋白质B之间是否有相互作用,你手中又有蛋白质A的特异抗体,就将蛋白质A和抗体加入到含有蛋白质B的细胞解液中去,利用抗体提纯,如果蛋白质A,B之间有相互作用,则最后提纯产物是抗体——蛋白质A——蛋白质B。由于最后终产物是多种蛋白质复合物,所以这种技术叫做co-immunoprecipitation,和IP的用途区别还是很大的。

  • 如何选择免疫共沉淀(Co-IP)实验抗体?



    多克隆抗体

    单克隆抗体

    单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合物)

    抗体抗原信号强度极佳由抗体的亲和力决定(极佳或者极弱) 极佳
    特异性通常很好,但有时会有非特异性相互作用 极佳,但有时会有交叉反应 极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 
    优点 亲和力高(由于抗体可以与目的蛋白的多个抗原决定簇相互作用) 特异性好,且可以无限量供应 特异性好,亲和力高(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 
    缺点非特异性相互作用很难去除 需要筛选亲和力高的抗体;抗原表位可能会被相互作用蛋白遮蔽 能够筛选得到的符合条件的单克隆并不多,所以单克隆抗体群也就不容易获得 
    免疫沉淀效果极佳(由于亲和力高) 由抗体的亲和力决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 
    免疫共沉淀效果
    通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性 有抗体的亲和力决定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)
    染色质免疫沉淀效果 通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性 由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交联实验所破坏决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 
  • CoIP免疫共沉淀实验目的蛋白高背景产生的原因及处理方法?

    目的蛋白高背景产生的原因有很多种,比如:1. 有非特异性蛋白结合; 2. 转移膜上的非特异性吸附。
    针对有非特异性蛋白结合这种情况,我们可以在无血清培养液中裂解细胞,而对于转移摸上的非特异性吸附,我们就要注意实验的操作问题,一定要戴手套,用镊子夹取,以及不接触转移膜转移面。

  • 免疫共沉淀CoIP实验如何避免假阳性?

    若抗体浓度过高,则降低抗体浓度;若抗体特异性不好,则更换抗体。

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