科研服务

Research Service

免疫共沉淀SILAC-IP

免疫共沉淀SILAC-IP实验原理
在分离纯化诱饵蛋白-互作蛋白复合物过程中,不可避免地会出现非特异结合蛋白,这些蛋白会一并被质谱鉴定出来,成为假阳性的互作蛋白,影响后续挑选验证。传统的判断假阳性互作蛋白方法是:用诱饵蛋白组鉴定到的蛋白列表,扣除掉对照组鉴定到的蛋白列表,作为“互作蛋白”。但很多真实的互作蛋白,比如丰度比较高的蛋白,在对照组中也会出现,而传统的方法就会被排除掉。

SILAC技术是先将实验组和对照组的蛋白带上不同的同位素,即重链、轻链氨基酸蛋白。复合物分离后,混在同一管中做酶切质谱等。这样既能鉴定到复合物蛋白,又能根据同位素峰强度判断诱饵蛋白组和对照组中蛋白的相对含量,从而更准确地判断出互作蛋白。


免疫共沉淀SILAC-IP实验方案
不同的实验背景和目的需对应用不同方案,辉骏生物提供以下三种SILAC-IP实验方案:

方案一:以野生型细胞株为实验材料
1.分别用轻、重链氨基酸培养细胞,取等量标记好的细胞提取蛋白质;
2.提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗bait蛋白的特异抗体做Co-IP;
3.混合轻、重链Co-IP产物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

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方案二:以过表达诱饵蛋白的细胞株为实验材料
1. 分别用轻、重链氨基酸培养正常对照细胞和过表达诱饵蛋白的细胞株(带标签),取等量标记好的细胞分别提取蛋白质,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用诱饵蛋白抗体做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

SILAC IP代做_silac ip外包平台.jpg
方案三:以干扰诱饵蛋白的细胞株为实验材料
1. 分别用轻链、重链氨基酸培养RNAi 诱饵蛋白的细胞株和正常对照细胞株,取等量标记好的细胞分别提取蛋白质,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用诱饵蛋白抗体做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

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免疫共沉淀SILAC-IP技术应用
体内条件下验证或寻找诱饵蛋白的结合蛋白。


几种蛋白互作技术特点
1. GST pull down:体外表达诱饵蛋白,简单易行,适合无IP级别抗体、又不易转基因的情况;
2. AP-MS:体内表达带标签的诱饵蛋白,洗脱产物无抗体污染,适合无IP级别抗体、但易转基因的情况;
3. TAP-MS:体内表达带双标签的诱饵蛋白,两次纯化,非特异结合蛋白更少,适合无IP级别抗体、但易转基因的情况;
4. CoIP:基本是天然蛋白复合物分离,能比较好的反应体内真实的蛋白互作情况,适合于有非常好的IP级别抗体的情况;
5. SILAC-IP:可定量鉴定分析体内蛋白复合物,适合于可传代细胞,尤其是易转基因细胞。

免疫共沉淀SILAC-IP服务*辉骏优势

1. 近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可;
2. 对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户情况提出合适的方案建议;
3. 自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线;
4. 自有蛋白质组学平台,对微量互作蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解;
5. 售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿。

免疫共沉淀SILAC-IP服务信息

项目名称

客户提供

结果交付

实验周期

 



SILAC-IP

已培养7代以上的SILAC标记细胞(同位素培养基由我方提供;如委托我方培养细胞,额外收费)
诱饵蛋白的IP级抗体
实验信息表

1、标记测试结果
2、诱饵蛋白WB检测图
3、质谱检测结果
4、生物信息学分析结果
5、实验报告

 



12-14周


免疫共沉淀SILAC-IP 客户文献

1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究内容】:为了更好地研究CREB/ATF家族成员SCIRR69在ER应激过程中的功能作用,研究者首先用ER应激激活剂(TG)和衣霉素(TM)处理了SCN和PC12细胞,,qRT-PCR和western结果显示SCIRR69可能在ER应激中起重要作用。采用SILAC IP方法筛选出ER过程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通过Co-IP技术验证了它们与SCIRR69的相互作用。研究结果有助于更好地理解SCIRR69在ER应激中的基本功能。

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2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究内容】:每个骨髓瘤患者都有多个亚克隆,具有高或低染色体不稳定性(CIN)特征的多个亚克隆共存会导致异质性和耐药性,导致疾病复发。作者通过串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术,发现了CIN基因NEK2与脱泛素酶USP7结合。该结合阻止了NEK2泛素化并使其稳定。研究发现,使用NEK2或USP7抑制剂进行靶向治疗可能是骨髓瘤最有效的辅助治疗方法。

使用相关技术:silac ip技术、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP质谱


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