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Pull-down

一.Pull down 的概念

       在Pull down实验中,带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获,形成“次级亲和支持物”,用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后,经Western blot验证或LC-MS/MS,即可证明或鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。

二.Pull down实验流程

                                                                         
图1. Pull down流程示意图

三.Pull down实验方案设计
1、构建含His或GST标签的诱饵蛋白原核表达载体;
2、原核表达诱饵蛋白(我们采用自诱导培养基培养细菌,能有效降低包涵体的形成);
3、细菌裂解液过柱,带标签的诱饵蛋白被固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”;
4、待测样品裂解液过柱孵育,与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附;
5、清洗,离心,去除未结合的杂蛋白;
6、洗脱,得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物;
7、如要验证某蛋白X与诱饵蛋白互作,则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育,做Western blot验证即可;
8、如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白,则需将6.所得的蛋白复合物做LC-MS/MS鉴定;

2. Pull down实验流程图


四.生物信息学分析
GO注释统计
GO注释统计

 
Pathway分析Pathway分析
 
                                                   
 
Pathway分析



五.Pull down实验技术服务内容
1、原核表达载体构建;
2、融合蛋白的诱导表达与纯化;
3、pull down捕获互作蛋白;
4、Western blot验证或LC-MS/MS鉴定互作蛋白;
5、数据检索、生物信息学分析;
6、结果分析与报告整理。

 

六.订购pull down技术服务须知
        为保证pull down实验顺利进行,请告知您的研究背景和目的,并提供目的蛋白对应的mRNA序列或对应基因的NCBI登录号,及拟用的融合标签。

 

七.实验周期及费用:咨询本公司。


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