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SILAC应用之蛋白质相互作用(SILAC-IP)

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一、SILAC研究蛋白质相互作用概述
        
SILAC (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC) 结合免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP) ,来寻找互作蛋白,是SILAC在定量蛋白质组学研究基础上的进一步应用。基本思路是通过质谱鉴定及分析蛋白的相对表达量来判断某一蛋白是否与诱饵蛋白特异结合,当实验组与对照组中某个蛋白质含量达到统计学差异时,即可判定该蛋白质与诱饵蛋白质存在互作。


 

二、与传统的免疫共沉淀(CoIP)或Pull down相比,SILAC-IP有以下优势
  1、特异性强,假阳性极低;      
  2高通量,液相与质谱连用,能最大限度的寻找到相互作用的蛋白质;    
  3、灵敏度高;
  4、能直接检测出与bait蛋白互作的其它蛋白的相对含量。

 

 

三、SILAC研究蛋白质相互作用技术流程

实验流程:



不同的实验背景和目的需对应用不同的SILAC-IP实验方案

方案一:以正常细胞株为实验材料
  1. 分别用轻、重链氨基酸培养细胞,培养至第5~6代时取等量细胞提取蛋白质;
  2. 提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗bait蛋白的特异抗体做免疫沉淀(IP);
  3. 混合轻、重链IP产物,SDS-PAGE分离;
  4. 胶内酶切,肽段抽提、纯化、鉴定和定量(图1:成对出现的峰为非特异性结合蛋白)。

 
正常细胞株的SILAC-IP实验设计
图1 正常细胞株的SILAC-IP实验设计

 

方案二:以过表达bait蛋白的细胞株为实验材料
  1. 分别用轻、重链氨基酸培养正常对照细胞和过表达bait蛋白的细胞株(带标签),培养至第5~6代时取等量细胞混合并提取蛋白质;
  2. 提取的轻链、重链细胞总蛋白均用标签蛋白抗体做IP;
  3. 混合轻、重链IP产物,SDS-PAGE分离;
  4. 胶内酶切,肽段抽提、纯化,质谱鉴定和定量(图2:成对出现的峰强一致的峰为非特异性结合蛋白)。

 
过表达细胞株的SILAC-IP实验设计
图2 过表达细胞株的SILAC-IP实验设计

 

方案三:以RNAi bait基因的细胞株为实验材料
  1. 分别用轻链、重链氨基酸培养RNAi bait基因的细胞株和正常对照细胞株,培养至第5~6代时取等量细胞混合并提取蛋白质;
  2. 提取的轻链、重链细胞总蛋白均用抗bait蛋白的特异抗体做IP;
  3. 混合轻、重链IP产物,SDS-PAGE分离;
  4. 胶内酶切,肽段抽提、纯化,质谱鉴定和定量(图3:成对出现且峰强一致的为非特异性结合蛋白;由于RNAi组的细胞株内bait蛋白含量下降,因而与其相互作用的蛋白的丰度也相对较低,表现为峰强的减弱)。
RNAi细胞株的SILAC-IP实验设计
图3 RNAi细胞株的SILAC-IP实验设计



四、SILAC研究蛋白质相互作用结果组成

                   图4SILAC分析蛋白质相互作用的质谱峰图及被鉴定蛋白的生物信息分析

 

五、SILAC研究蛋白质相互作用技术服务内容
1、细胞同位素标记;(本公司出售L、M、H型Lys和Arg)
2、样本制备与定量
3、SDS-PAGE分离、酶切、LC-MS/MS分析
4、蛋白定性及定量分析;
5、互作蛋白的生物信息学分析
6、实验报告整理。


 

六、SILAC适用
    
SILAC能标记活的可传代细胞、细菌等材料,不能标记组织、体液等样本,详情请咨询我司。


 

七、实验服务报告内容
  1、蛋白质鉴定;
  2、SILAC鉴定相互作用蛋白质的分析结果;  
  3、顾客指定蛋白质对应的质谱峰图;  
  4、完整的技术服务报告,包括实验步骤、使用试剂、仪器、软件检索参数等。


 

八、实验服务周期及收费标准:咨询本公司

 

九、质量承诺
 1、根据您的实验目的为您设计科学合理的SILAC实验方案;
 2、提供客观、真实的实验结果。

 

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