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蛋白质互作:串联亲和纯化(TAP-MS)

技术简介:
        蛋白质互作研究按照实验目的可分为两大类,一是验证两个蛋白是否存在相互作用,二是筛选某个兴趣蛋白的互作蛋白。
        目前,常用的蛋白质互作分析技术有:免疫共沉淀(CO-IP),pull-down、串联亲和纯化法(tandem affinity purification,TAP)和基于SILAC技术的免疫共沉淀(SILAC-IP)等。
        其中CO-IP、Pull-down常被用来验证两个蛋白的相互作用;虽然CO-IP或Pull-down结合质谱的方法也可用来筛选互作蛋白,但常常会带来很多假阳性结果;因此,TAP和SILAC-IP技术在筛选互作蛋白的研究方面表现出了一定优势。
        串联亲和纯化技术 (tandem affinity purification,TAP)与COIP技术筛选互作蛋白的原理类似。不同的是TAP技术使诱饵蛋白带上了2个纯化标签,利用标签对蛋白复合物进行了两轮纯化(串联亲和纯化),使洗脱液中的非特异性蛋白降至较低水平。结合LC-MS/MS技术,分别鉴定出实验组和阴性对照组洗脱液中的蛋白质种类,从而找到实验组中独有的蛋白质,即可能的互作蛋白。


应用领域:
        信号通路研究:寻找特定目标蛋白的互作蛋白。


技术流程:
        构建诱饵蛋白的双标载体——包装慢病毒——筛选稳转株——提取总蛋白——串联亲和纯化——洗脱液的蛋白酶解——LC-MS/MS——蛋白质定性和定量结果——筛选实验组独有蛋白


技术优点:
        1. 捕获到的是天然互作的蛋白,符合体内真实生理情况,可信度高。
        2. 采用两步纯化,能有效减少假阳性率。


参考文献:
        1.Proteomic Analysis of the Human Cyclin-dependent Kinase Family Reveals a Novel CDK5Complex Involved in Cell Growth and Migration.Mol Cell Proteomics. 13(11):2986-3000(2014).
        2.Defining the protein-protein interaction network of the human protein tyrosine phosphatase
        3.Family.Mol Cell Proteomics. 15(9):3030-44(2016).
        4.Novel interacting proteins identified by tandem affinity purification coupled to nano LC-MS/MS interact with ribosomal S6 protein kinase 4 (RSK4) and its variant protein (RSK4m). Int J BiolMacromol. 96:421-428(2017).

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