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蛋白质浓度测定的三种方法—UV法,BCA法,考马斯亮蓝法

测定蛋白质浓度的方法有各有不同,辉骏生物以UV法,BCA法,考马斯亮蓝法,其中的三种方法的测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项做详细介绍。

辉骏生物:蛋白质浓度测定

UV法

这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受 到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。

 

(1)简易经验公式

蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

 

(2)精确计算

通过计算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通过如下公式计算最终结果:

蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d为测定OD值比色杯的厚度,D为溶液的稀释倍数


BCA法

原理

BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿,即 BCA 工作试剂。在碱性条件下,BCA 与蛋白质结合时,蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+,工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

 


考马斯亮蓝法

 实验原理

考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。目前,这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。
 

考马斯亮蓝 G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置,由 465 nm 变为 595 nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。
 

突出优点

(1)灵敏度高,据估计比 Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。
 

(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要 2 分钟即可完成,其颜色可以在 1 小时内保持稳定,且在 5 分钟至 20 分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。
 

(3)干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。


缺点

(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。

 

试剂与器材

1、试剂

考马斯亮蓝试剂:

考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中,加入 100 mL 85% 磷酸,用蒸馏水稀释至 1000 mL。
 

2、标准和待测蛋白质溶液

(1)标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。

(2)待测蛋白质溶液。

人血清,使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。
 

3、器材

试管 1.5×15 cm(×6),试管架,移液管管 0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。

 

操作方法

一、制作标准曲线

取 7 支试管,按下表平行操作。摇匀,1 h 内以 0 号管为空白对照,在 595 nm 处比色。绘制标准曲线:以 A595 nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。

 

二、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上,取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

 

注意事项

(1)在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。
 

(2)测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
 

(3)利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定,防止误差。

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