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「辉骏客户文章」J Natl Cancer Inst| Circ-FBXW7在抑制胶质瘤发生中的新作用

发布时间:2021/1/25 10:48:46 作者:辉骏生物

背景:环状RNA(CircRNA)是广泛存在于真核生物基因组中的RNA转录本。据报道,circRNA在组织发育、基因调控和癌症发生中都起着重要作用,是近年来的一大研究热点。然而,对于circRNA是否编码功能蛋白还有待进一步探究。

内容概述:
2017年8月,辉骏生物合作伙伴,中山大学附属第一医院神经外科张弩教授团队在期刊J Natl Cancer Inst(IF2017=11.238)上发表题为“Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis“的文章。他们发现Circ-FBXW7在人正常脑组织中大量表达,跨越环形接口的Circ-FBXW7开放阅读框由内部核糖体进入位点(IRES)驱动,编码一种新的21 kDa的蛋白质,命名为FBXW7-185aa。FBXW7-185aa的上调抑制了癌细胞的增殖和细胞周期的加速,而FBXW7-185aa的下调则促进了体内和体外的恶性表型。FBXW7185aa通过拮抗USP28诱导的c-Myc稳定化,缩短了c-Myc的半衰期。此外,胶质母细胞瘤临床标本中Circ-FBXW7和FBXW7185aa的表达水平均低于其对应的癌旁组织,Circ-FBXW7的表达与胶质母细胞瘤患者的总生存期呈正相关。研究结果提示内源性CircRNA在人类细胞中编码一种功能蛋白,Circ-FBXW7和FBXW7-185aa对脑癌具有潜在的预后意义。

主要技术:
RNA seq、Pull-down、CoIP荧光素酶分析蛋白质谱检测(LC-MS/MS)
辉骏生物为本研究提供了蛋白质谱检测和分析服务

研究路线:
CircRNA研究路线.png

研究结果:
1. CircRNA在人脑胶质母细胞瘤及癌旁正常组织中具有不同表达模式
为了建立circRNA表达谱数据库,研究者对临床胶质母细胞瘤组织及其癌旁正常组织的核糖体RNA进行了RNA-seq分析,共鉴定出31145个circRNA,其中6442个能与circBase数据库匹配(图1A);注释后发现这些circRNA大多来自编码蛋白的外显子,还有一些来自内含子、UTR或反义序列 (图1B)。这些已鉴定的circRNA大多数小于1500nt(图1C),且在癌症组和正常组的染色体分布无明显差异,而癌症组中的circRNA总表达下调(图1D,E)。癌症组和肿瘤组具有不同的circRNA表达模式(图1F)。研究者将癌症组和正常组之间差异最大的候选基因与circRNADb数据库匹配,在这些特定的候选基因中,由FBXW7基因外显子3和外显子4环化而成的新基因Circ_022705引起了研究者的注意(图2A)。

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2. 环状RNA circ-FBXW7的鉴定

为了验证FBXW7基因的外显子3和4是否形成了内源性circRNA,研究者分别采用收敛和发散引物扩增cDNA和基因组DNA(gDNA),其中发散引物扩增cDNA可获得阳性条带,且该产物可以抵抗RNase-R降解,但扩增gRNA没有任何产物,证明了确实存在首尾相连的circ-FBXW7 (图2B)。接着,作者采用qPCR方法检测了100例胶质瘤标本和100例正常脑组织中Circ-FBXW7的表达,显示其在胶质瘤中的表达低于正常脑组织,该结果与RNA-seq一致(图2C)。Sanger测序发现了620nt的circ-FBXW7,而非Circbase数据库收录的1227nt的circ-FBXW7 (hsa_circ_0001451),推测可能是由于内含子序列的剪切所致。使用接口特异性探针的Northern blot检测也确定了内源Circ-FBXW7的存在(图2E)。为了确定Circ-FBXW7的定位,FISH实验分别检测野生型、转染circ-FBXW7 siRNA和转染NC siRNA的293T细胞,结果表明Circ-FBXW7主要存在于胞浆中;对不同细胞组分的qPCR分析也进一步证实,circ-FBXW7主要定位于细胞质(图2F)。
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3. Circ-FBXW7编码能力的评估
研究者分析了circ-FBXW7的开放阅读框(ORF),发现在circ-FBXW7中有一个潜在的跨接口的ORF,编码185个氨基酸 (图3A)。他们采用双荧光素酶报告基因系统分析了circ-FBXW7的IRES活性,结果显示全长IRES诱导的荧光素酶活性显著高于截短或突变的IRES (图3B)。接下来,通过构建一系列载体并转染细胞,发现circ-FBXW7-flag细胞可检测到约22 kDa的蛋白(图3C),LC-MS/MS技术鉴定该蛋白的序列,接口处的氨基酸检测结果进一步表明这个新的蛋白质是由Circ-FBXW7编码的(图3C,D)。
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4. FBXW7-185aa对胶质瘤细胞的作用及其分子机制
为了确定Circ-FBXW7编码蛋白的功能,研究者建立了稳定过表达circ-FBXW7的U251和U373细胞,以IRES突变的载体为阴性对照,此外为了排除环形RNA本身的作用,同时建立了FBXW7-flag表达组(图3C)。跨接口引物做qPCR确认了Circ-FBXW7和circ-FBXW7-IRES mut的转录(图4A),WB确定了circ-FBXW7和FBXW7-flag组中的蛋白表达(图4B)。接下来,研究者检测了细胞周期和细胞增殖率。Circ-FBXW7和FBXW7-flag稳定过表达细胞与IRES突变组细胞相比,表现出大量的G1期阻滞(图4C),存活率也大大降低(图4D,E)。用接口特异性的shRNA敲除Circ-FBXW7后,WB结果显示FBXW7-185aa的表达降低(图4F),细胞周期加速,细胞存活率升高(图4G-I)。这些结果表明,FBXW7-185aa(而不是Circ-FBXW7 RNA)诱导了胶质瘤细胞周期停滞,抑制细胞增殖。
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FBXW7α是FBXW7亚型中含量最丰富的,它是一种E3连接酶,可以靶向c-Myc进行泛素化降解。FBXW7-185aa高表达会引起c-Myc的蛋白表达下降,而其RNA水平不变(图5A)。鉴于上述证据,研究者推测FBXW7-185aa可能与c-Myc蛋白的稳定性有关。半衰期实验证实,FBXW7-185aa可降低c-Myc稳定性,且FBXW7-185aa比FBXW7α更稳定(图5B)。据报道,去泛素化酶USP28通过与FBXW7α的N端相互作用,抑制FBXW7α对c-Myc的降解,而FBXW7-185aa不包含与c-myc互作的C端结构域,因此推测FBXW7-185aa可能通过USP28破坏c-Myc的稳定性。Pull-down实验和CoIP实验表明,FBXW7-185aa可以结合USP28 (图5C,D),且与USP28具有更高的结合力,增加FBXW7-185aa可以竞争性地将FBXW7α从USP28中释放出来(图5E)。体内和体外泛素化实验表明,FBXW7-185aa过表达可抑制USP28诱导的c-Myc去泛素化。然而,仅凭FBXW7-185aa并不能泛素化c-Myc(图5F),在FBXW7α缺失情况下过表达FBXW7-185aa也不能抑制c-Myc的表达,表明FBXW7-185aa通过FBXW7α调节c-Myc。此外,过表达USP28抑制了FBXW7-185aa诱导的c-Myc下降(图5G)。以上证据共同阐明了FBXW7-185aa与USP28竞争性相互作用并“释放”FBXW7α,降解c-Myc。
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5. Circ-FBXW7和FBXW-185aa的临床意义
为了探索FBXW7-185aa潜在的临床意义,研究者检测了FBXW7-185aa在胶质瘤细胞系及患者中的表达水平。与对照细胞(NHA和293T)相比,Ⅲ级胶质瘤细胞(SW1783和Hs683)和胶质母细胞瘤细胞(U251和U373)中的FBXW7-185aa表达更少。在胶质母细胞瘤患者样本中FBXW7-185aa和Circ-FBXW7的表达也相对降低(图6A),且Circ-FBXW7低表达的胶质母细胞瘤患者总生存期更短(图6B)。由于常见的FBXW7α突变不影响Circ-FBXW7或FBXW7-185aa,因此研究者推测Circ-FBXW7和FBXW7-185aa是胶质母细胞瘤的独立预后标记物。过表达circ-FBXW7的U251和U373细胞显示出比对照细胞低得多的致瘤性(图6C),小鼠的寿命也更长(图6D)。
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结论
本研究首次发现了circ-FBXW7可以编码一种有功能的新蛋白质FBXW7-185aa,其通过竞争结合去泛素化酶USP28使之释放FBXW7α,降低c-myc蛋白水平,最终抑制胶质瘤细胞增殖和细胞周期。

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