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lncRNA编码蛋白SMIM30激活MAPK通路促进肝癌发生

发布时间:2021/1/26 14:33:34 作者:辉骏生物

原标题:Peptide SMIM30 promotes HCC development by inducing SRC/YES1 membrane anchoring and MAPK pathway activation.
期刊:Journal Of Hepatology
影响因子:18.946
关键词:lncRNA翻译,LINC00998,SMIM30,SRC,YES1,肝细胞癌
主要技术方法:质谱检测(LC-MS/MS),RNA免疫共沉淀(RIP-Seq),染色免疫共沉淀(ChIP-qPCR),双荧光素酶报告基因,免疫共沉淀(CoIP-MS),RNA-seq等。

除了典型的蛋白质编码基因之外,很多非编码RNA(例如lncRNA)能够影响细胞过程,在各种人类癌症中也经常观察到lncRNA的水平失调。虽然lncRNA最早被认为是一种非编码RNA,但近年来越来越多的证据表明,一些lncRNA含有小的开放阅读框(SmORF),并且其编码的小肽具有生物学功能。

2020年5月,上海第二军医大学长海医院的研究人员发现肝癌细胞中高表达的LINC00998编码一种内源性小肽“SMIM30”,该小肽(非RNA)可以通过调节细胞增殖和迁移促进肝细胞癌(HCC)肿瘤发生,其水平与HCC患者的不良生存率相关。SMIM30由c-Myc转录,然后驱动非受体酪氨酸激酶SRC/YES1的膜锚定,进而激活下游MAPK信号通路,促进肝癌的发生发展。该研究不仅揭示了ncRNA编码的多肽促进肝癌发生的新机制,而且提示这些多肽可以作为肝癌治疗的新靶点和肝癌诊断和预后的新生物标志物。

1.    发现肝癌细胞中高表达的LINC00998编码内源性小肽“SMIM30”
使用核糖体蛋白S6(RPS6)抗体对4种癌细胞进行RNA免疫共沉淀和高通量测序(RIP-Seq),发现4种癌细胞中同时富集到的lncRNA共105个。通过潜在编码框(SmORF)分析、CPC编码潜能预测、GEPIA数据库分析和新鲜冷冻组织的PCR,发现具有编码潜能的LINC00998在HCC和癌旁组织中差异表达。RIP-qPCR再次确认了LINC00998可以结合RPS6,说明LINC00998可能定位于活跃翻译的核糖体,潜在编码一种功能肽。数据库查找发现,LINC00998的潜在编码肽收录在uniprot中,命名为“SMIM30”,但缺乏多肽表达的证据及功能信息。PCR结果显示LINC00998末端具有polyA结构。外源载体构建和细胞表达检测,以及内源SMIM30抗体调取和LC-MS/MS分析,都确认了SMIM30肽的表达。免疫荧光和WB实验表明SMIM30蛋白定位于细胞膜上,可能是一种保守的疏水膜肽。

2.    SMIM30肽通过调节细胞增殖和迁移促进HCC进程
接下来,通过shRNA慢病毒抑制了HCC细胞中LINC00998和SMIM30的水平。CCK8、transwell、流式周期检测等细胞实验表明,LINC00998/SMIM30下调干扰了细胞周期,抑制了细胞的增殖和迁移。为了确定这一效应是由LINC00998的RNA水平改变导致,还是由于编码多肽的减少导致,作者构建了起始密码子突变而不能表达SMIM30的载体。功能回补实验显示,smORF突变的载体不能弥补LINC00998干扰的效应,说明LINC00998的编码肽SMIM30,而不是其lncRNA,促进了HCC细胞的恶性行为。体内实验显示,SMIM30敲除组的小鼠肿瘤更小,肺转移也更少。这些结果表明LINC00998编码的SMIM30肽通过正向调节细胞增殖和迁移促进HCC发展。

3.    SMIM30肽与受体酪氨酸激酶SRC/YES1相互作用
为了确定SMIM30肽的作用机制,在表达flag- SMIM30的细胞中用flag抗体做CoIP-MS,筛选到了与SMIM30相互作用的蛋白质——非受体酪氨酸激酶SRC/YES1。LINC00998敲除并没有改变SRC和YES1的蛋白水平,但使其磷酸化水平发生了变化,SMIM30的转染又逆转了这一变化,说明SRC/YES1的激活状态与SMIM30的表达水平有关。另外,它们之间的相互作用不受RNase处理的影响,表明这种互作不依赖于RNA。内源性的Co-IP实验确认了它们之间的结合,免疫荧光也显示SRC/YES1和SMIM30肽在细胞质外缘共定位。之后,作者构建了一系列的SRC/YES1结构域突变载体,最终确定SRC/YES1的N端膜结合结构域对它们与SMIM30肽之间的互作是必需的。

4.    SMIM30肽激活MAPK信号通路并受到c-myc调控
接下来,研究者对SMIM30沉默的HCC细胞进行了转录组测序(RNA-seq),GO分析表明,一些差异基因富集在膜靶向蛋白和膜锚定蛋白条目中。KEGG pathway分析表明一些差异基因富集在MAPK信号通路中。通过SMIM30敲除实验,发现MAPK通路下游一些基因的磷酸化水平发生了变化,SMIM30-ORF的加入会逆转这种变化。作用采用Co-IP方法进一步确定了SMIM30、SRC/YES1和MAPK通路之间的关系,SMIM30起衔接SRC/YES1和integrin β1的作用(integrin β1介导MAPK通路),当SMIM30低表达时,SRC/YES1和integrin β1之间的结合减弱。此外,作者利用JASPAR工具预测了可能结合SMIM30启动子的转录因子——c-myc。ChIP实验表明c-Myc可以和预测的启动子位点结合,双荧光素酶报告基因证实c-Myc能增强SMIM30的转录。

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