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「辉骏客户文章」AR诱导的长链非编码RNA LINC01503通过SFPQ- FOSL1轴促进鼻咽癌的增殖和转移

发布时间:2021/4/2 17:12:19 作者:辉骏生物

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背景:
鼻咽癌(NPC)是一种起源于鼻咽腔粘膜的上皮恶性肿瘤,超过70%的NPC病例被诊断为晚期疾病,局部复发和远处转移是NPC死亡的两个主要原因。越来越多的研究表明,长的非编码RNA(lncRNA)在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。然而,lncRNA在鼻咽癌(NPC)中的功能和调控机制仍然未知。

内容概述:

2020年7月,中山大学肿瘤防治中心在期刊MS-Oncogene(IF2020=7.971)上发表题为“AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma”的文章,发现LINC01503在NPC中高表达并与不良预后有关,在体外促进NPC细胞的增殖,迁移和侵袭,在体内促进肿瘤的生长和转移。LINC01503募集了富含脯氨酸和谷氨酰的剪接因子胺(SFPQ)来激活Fos like 1(FOSL1)转录,而FOSL1的过表达逆转了LINC01503敲低对NPC进展的抑制作用。此外,雄激素受体(AR)介导的转录激活是NPC细胞中LINC01503过表达以及AR配体依赖性细胞生长、迁移和侵袭的原因。这些发现表明,AR诱导的LINC01503可以通过SFPQ-FOSL1通路促进NPC发展,或成为新的NPC预后标志物和治疗靶标。

主要技术:

RNA pulldownRIP、RNA-Seq、ChIP荧光素酶报告实验、过表达/敲除实验、体内肿瘤异种移植模型构建;
辉骏生物为本研究提供了蛋白检测和分析服务。

研究路线:

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研究结果:
1. LINC01503在鼻咽癌中高表达与预后不良相关
基于该实验室之前的全基因组lncRNA表达谱数据,研究者发现LINC01503在鼻咽癌组织中高表达(图1a);之后,对20例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽组织中LINC01503水平的qPCR检测确定了这一结果 (图1b)。此外,LINC01503在11个鼻咽癌细胞系中表达均显著上调(图1c)。接下来,他们检测了来自鼻咽癌患者的214例石蜡包埋肿瘤组织中LINC01503的表达,以评估其临床意义。Kaplan-Meier分析显示,高水平LINC01503的患者总体存活率更差(图1d-f)。接下来,结合LINC01503表达和TNM分期数据,构建了一个预测鼻咽癌预后的模型。鼻咽癌患者按低危组、中危组和高危组分为三组,Kaplan-Meier曲线表明这三组显示出了不同的生存前景(图1g-i)。这些结果表明,LINC01503在鼻咽癌中表达上调,可作为判断鼻咽癌预后的生物标志物。
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2.LINC01503促进鼻咽癌细胞体外生长、迁移和侵袭
接着,研究者敲低了鼻咽癌细胞(HK1)中的内源性LINC01503,并进行RNA-seq研究受其影响的基因。GSEA分析发现,恶性肿瘤增殖和转移相关的基因与LINC01503水平呈负相关(图2a),证实了LINC01503与鼻咽癌发展密切相关。为了验证这些发现,研究者接着对敲低LINC01503的HK1和SUNE1细胞进行了体外功能分析(图2b)。CCK-8和克隆形成实验表明,LINC01503基因的敲低显著抑制了鼻咽癌细胞的生长和增殖(图2c,d)。伤口愈合和Transwell分析也表明,LINC01503基因敲低抑制了鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力(图2e,f)。这些结果表明,LINC01503在体外可以促进鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭。
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3.LINC01503与SFPQ直接结合
核质RNA提取检测发现LINC01503位于HK1和SUNE1细胞的胞核和胞浆中(图3a)。接着,研究者用生物素标记的LINC01503正义或反义序列进行RNA pull-down MS实验,鉴定与LINC01503结合的蛋白质 (图3b),并发现剪接因子SFPQ在RNA pull down产物中高度富集(图3c)。RIP实验进一步验证了SFPQ与LINC01503之间的相互作用 (图3d)。沉默LINC01503取消了其与SFPQ之间的相互作用(图3e)。此外,FISH结果显示LINC01503与SFPQ共存于HK1和SUNE1细胞的细胞核中(图3f)。为了确定LINC01503与SFPQ结合的区域,研究者构建了一系列LINC01503截短质粒,再次进行RNA pull-down实验。结果表明,LINC01503236-544nt区域的236-544nt是与SFPQ相互作用所必需的(图3g)。然而,LINC01503的下调或过表达都不影响SFPQ的mRNA或蛋白水平(图3h,i)。这些结果表明LINC01503可以直接结合SFPQ。
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4.LINC01503招募SFPQ激活FOSL1转录
作为一种多功能的核蛋白,SFPQ可以作为转录抑制因子或激活因子调节基因表达。为确定LINC01503/SFPQ在鼻咽癌中的靶基因,研究者通过RNA-Seq分析了LINC01503基因敲除前后HK1细胞的差异表达基因。在前20个上调和下调的基因中,FOSL1引起了研究者的注意(图4a)。FOSL1高表达且与LINC01503在鼻咽癌组织中的表达呈正相关(图4b,c),LINC01503或SFPQ的敲除都可以降低FOSL1的mRNA和蛋白水平(图4d,e)。Transfac和Weblogo程序预测到FOSL1基因的启动子区有两个SFPQ结合位点(图4f,g)。ChIP-qPCR结果显示,LINC01503基因敲除可显著消除FOSL1启动子区域SFPQ的富集(图4h)。此外,荧光素酶报告基因实验表明,SFPQ的过表达显著增加了FOSL1野生型启动子下游的荧光素酶活性,但不能增加突变启动子下游的荧光素酶活性(图4i)。最后,DNase I酶切分析表明,LINC01503或SFPQ基因敲除显著抑制了FOSL1启动子位点的染色质可及性(图4J)。这些结果表明,LINC01503可以招募SFPQ激活FOSL1转录活性并增加其表达。
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5.LINC01503/SFPQ通过激活FOSL1促进鼻咽癌发展
为确定LINC01503/SFPQ是否通过激活FOSL1促进鼻咽癌的发展,研究者在HK1和SUNE1细胞中敲除LINC01503,之后再过表达FOSL1。CCK-8和克隆形成实验表明,LINC01503基因敲除对细胞生长和增殖的抑制作用被FOSL1的过表达挽救(图5a-c)。此外,Transwell分析表明,LINC01503的过表达逆转了LINC010503基因敲除对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(图5D)。这些结果表明LINC01503通过激活FOSL1促进鼻咽癌的进展。
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6.LINC01503基因敲除对鼻咽癌生长和转移的抑制作用
为确定LINC01503在鼻咽癌生长和转移中的作用,研究者通过注射shLINC01503建立了小鼠肿瘤模型。结果显示,LINC01503敲除显著延缓了肿瘤生长(图6a),ShLINC01503组形成的肿瘤体积和重量都比对照组小(图6b,c)。接下来,研究者通过注射shLINC01503建立腹股沟淋巴结转移模型(图6d),结果显示,ShLINC01503组腹股沟淋巴结较小,重量较轻(图6e,f)。H&E染色显示,LINC01503基因敲除组的肿瘤侵袭性较弱,对皮肤和肌肉的侵袭能力减弱(图6g)。此外,根据角蛋白阳性细胞的检测,shLINC01503组的腹股沟淋巴结转移率明显低于shCtrl组(图6h,i)。最后,研究者通过注射shLINC01503建立了肺转移定植模型,发现shLINC01503组肺表面转移结节比对照组少(图6j)。此外,H&E染色显示shLINC01503组的转移结节比shCtrl组的转移结节更少、更小(图6i)。这些数据表明,LINC01503在体内促进了鼻咽癌肿瘤的生长和肺转移。
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7.AR激活LINC01503转录增加其在鼻咽癌中的表达
研究者通过Jaspar软件预测了两个转录因子ALX Homeobox 3(ALX3)和AR与LINC01503启动子的结合(图7a)。实验发现,AR敲除明显降低了LINC01503的水平,而ALX3敲除并没有降低LINC01503的表达(图7b)。此外,AR的过表达增加了LINC01503的RNA表达(图7c),AR在鼻咽癌中表达上调,并与LINC01503的表达呈正相关(图7d,e)。接下来,他们用Jaspar软件预测了LINC01503启动子区域的两个高亲和力结合位点(图7f)。ChIP-PCR分析显示AR过表达显著增强了其在LINC01503启动子区域的富集(图7g)。此外,AR的敲除显著降低了野生型LINC01503启动子下游的荧光素酶活性,但对突变启动子活性没有影响(图7h)。最后,通过DNase I酶切实验观察到AR敲除显著损害了LINC01503启动子位点的染色质可及性(图7i)。这些结果表明,AR激活了鼻咽癌中LINC01503的转录。
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之后,研究者又进一步了阐明LINC01503的水平是否受到AR配体影响。结果表明,在AR激动剂双氢睾酮(DHT)或拮抗剂苯扎鲁胺(Enz)处理后,LINC01503分别上调或下调,且呈时间和剂量依赖特征 (图8a,b)。此外,DHT或Enz的处理还导致了细胞增殖、迁移和侵袭能力的增加或下降 (图8c-e)。在Enz处理的基础上过表达LINC01503,发现Enz对细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用可以被LINC01503的过表达所逆转(图8f-h)。这些结果证实了AR拮抗剂Enz可能通过阻断LINC01503的上游转录来抑制鼻咽癌的恶性发展。
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结论:
本研究发现LINC01503在鼻咽癌中高表达,与不良预后和较低的生存率有关。AR激活了鼻咽癌中LINC01503的转录,使LINC01503募集SFPQ到FOSL1启动子,增加FOSL1转录,促进鼻咽癌的发展。抑制LINC01503的表达和开发AR配体拮抗剂可能成为NPC的一种靶向治疗策略。

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