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iTRAQ实验技术研究细胞内基质揭示MMP-2底物降解组

摘要:蛋白酶底物降解的阐明对于理解蛋白酶网络中蛋白水解途径和蛋白酶如何调节细胞的功能是必要的。作者在细胞中,利用一种新的多通道蛋白组学实验技术鉴定了基质金属蛋白酶-2(MMP-2)分解的蛋白、溶解的细胞周围基质和脱落的细胞外域。在不同的时间点,从通过转染实验技术表达低水平的人类MMP-2的成纤维细胞Mmp2-/-的条件培养基中收集到完整的胰蛋白酶肽和裂蛋白质,用ITRAQ质量标签进行胺标记示踪。在活性和非活性蛋白酶转染子之间,肽的鉴定和相关定量,通过在串联质谱期间标记碎片达到。MMP-2已知的底物被鉴定,因此用许多新的MMP-2底物来确认这种技术,包括趋化因子CX3CL1、骨架蛋白、凝集素-1和HSP90α,并用生物化学实验技术证实。与ICAT标记和定量实验技术相比,iTRAQ实验技术更为敏感。“肽图谱”,通过iTRAQ实验技术在一种特殊蛋白内鉴定多种肽的定位,结合他们的相对丰度,可以确定在天然细胞基质中结构域脱落以及裂解位点的大体位置。因此,作为天然蛋白质基质的细胞筛选的在降解组中的这个进展,为细胞功能中蛋白酶的作用提供了新的依据。


实验方法:本文首先通过转染实验技术使成纤维细胞Mmp2-/-低水平的表达人类的MMP-2,收集完整的胰蛋白酶肽和裂蛋白质后,分别用iTRAQ实验技术和ICAT标记实验技术进行标签胺标记示踪,然后通过多维的液相色谱实验技术和串联质谱实验进行鉴定和相关定量。最后,通过western blot实验技术和生物信息学实验方法进一步证实。与ICAT标记实验技术相比,iTRAQ实验技术明显更敏感。


意义:iTRAQ实验技术为研究细胞功能中蛋白酶的作用提供了新的依据,并且证实该技术比ICAT实验技术更为敏感。


文献来源:Molecular & Cellular Proteomics 6:611–623, 2007.

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