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双向电泳原理及操作步骤

实验概要
本文介绍了双向电泳原理及操作步骤(第一向等电聚焦和第二向SDS-PAGE电泳)。

实验原理
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术(根据蛋白质等电点进行分离)以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据蛋白质的大小进行分离)。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中(φ1~3 mm)中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合。
将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中,结合 SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离。
这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。

实验步骤
1. 第一向等电聚焦
   1) 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解。
   2) 在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混匀。
   3) 从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀。
   4) 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7),室温中放置10分钟。
   5) 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
   6) 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
   7) 分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有 )对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。
   8) 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
   9) 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。
   10) 聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。
2. 第二向SDS-PAGE电泳
  1) 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。
   2) 待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。
   3) 从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。
   4) 配制胶条平衡缓冲液I。
   5) 在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
   6) 将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
   7) 配制胶条平衡缓冲液II。
   8) 第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
   9) 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上。
   10) 将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
   11) 将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
   12) 第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。
   13) 将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
   14) 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
   15) 用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。
   16) 放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
   17) 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
   18) 在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
   19) 电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。
   20) 进行染色。




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