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聚焦过程中出现的问题及解决办法

一、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦不论在制胶、电泳和染色过程中都比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS电泳有较多的技术问题需要解决,如制胶不易聚合,电泳时易烧胶,脱色时背景不易脱净等。但是只要掌握等电聚焦技术的原理,就能解决这些问题而得到高分辨和满意的结果。
凝胶聚合不佳,胶软,粘
1.系统中使用的试剂和水不纯(应该用双蒸水配制溶液)。
2.系统中有醇、巯基化合物或灰尘影响聚合。
3.凝胶浓度和关联度太低(有时是由于丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺溶解不佳造成的)。
4.过硫酸铵(粉末或溶液)和TEMED保存期太长,不能起催化作用。
5.贮液保存期太长,抽气不充分。
6.聚合时温度太低,最好在30~40℃聚合。
7.如用核黄素催化的光聚合,应使用近紫外的光源,如荧光灯,不要用钨灯泡,并采用尽可能薄的玻璃,不要用塑料板。
8.核黄素在碱性pH范围不能催化光聚合。
● 接通电源后没有电流,电流太低或电流随电泳增加
1.如果接通电源后没有电流,也没有电压,应检查外线电源是否正常工作?电源的保险丝是否完好?电源和电泳槽的连接插头是否已插好?
2.如果仅仅没有电流或电流很小,应检查凝胶、电极条与电极之间的接触是否良好?
3.检查电极条上的电极液是否充分?
4.如果在等电聚焦过程中,电压逐渐下降,电流逐渐上升,应检查电极或电极液是否阴、阳极错置?
● 接通电源后电流太高或在电泳过程中电流突然升高
1.电流太高通常是由于在凝胶或样品中有过量的盐。
2.电流突然升高是烧胶(原因下述)的前奏,应立即关掉电源。
● 等电聚焦过程中冷凝水的出现
   等电聚焦过程中出现冷凝水虽然是常见现象,但它是烧胶的征兆,所以应予密切注意。
1.如果在整块胶面上出现冷凝水是由于功率(电压)设置太高或由于冷却不充分。应重新设置温度,检查循环冷却水的运行,凝胶与冷却板的接触。在夏天时,冷却温度不要设置太低,以免潮湿空气凝聚在凝胶周围。
2.在加样上方出现冷凝水,说明加样过多或样品中有盐。
3.电极沿边的冷凝水常常是由于过多,过浓的电极液造成的,有时还因此而引起在凝胶上的压痕。
4.在凝胶的碱性侧或阴极沿边出现冷凝水通常是由于凝胶介质的电内渗引起的。
5.在凝胶的部分位置出现冷凝水是由于凝胶与冷却板之间有气泡,接触不好。
6.如果在凝胶上一条线区域出现冷凝水可能是由于载体两性电解质在此pH范围的导电性不佳引起的,特别是使用窄pH范围的电解质,过长的聚焦时间可能也是原因。
● 打火花和烧胶
   凝胶上出现冷凝水是打火花和烧胶的前奏,所以要避免冷凝水的出现。
1.如果烧胶是沿着电极条边缘,可能是由于电极条太长。电极条应比凝胶短几毫米。、
2.如果烧胶是沿着阴极条边缘,可能是由于凝胶介质较长时间与碱性电极液接触而水解。如果样品数目多,最好先加样,后加阴极电极条。
3.如果在pH7纯水区烧胶,应在制胶时加适量pH3~10或pH6~8的载体两性电解质。
● 不能得到预期的pH梯度
1.电泳过程中产生梯度漂移,也称平台现象,可能是由于介质中丙烯酸引起阴极漂移所致。
2.单体贮液时间太长。
3.聚焦时间太长。
4.载体两性电解质导电性不均匀。
● pH梯度的碱性部分被丢失
1.凝胶溶液吸收了大气中的二氧化碳。
2.凝胶介质的电内渗。
3.在电泳时,载体两性电解质和电极液被氧化。
● pH梯度成波纹状
1.凝胶聚合时加过多的过硫酸铵。
2.电极液保存时间太长,电极液太多,不均匀。
3.凝胶,电极条,电极液接触不好。
4.电极丝不直或不干净。
5.尿素胶贮存时间太长。
6.如果波纹主要在加样位置,说明蛋白浓度太高或样品中有较高浓度的盐。
● 蛋白带的拖尾和纹理现象
1.样品溶解不好,有沉淀颗粒。
2.加样器或加样滤纸片在凝胶上放置时间太长。
3.样品放置时间太长或已变性。
4.样品分子量大,慢慢进入并堵塞凝胶。
● 蛋白带偏斜
1.凝胶不成规则的矩形或正方形。
2.阴、阳电极条长度不一致。
3.电极或电极条的放置不平行。
● 蛋白带不细窄
1.低分子量蛋白在等电聚焦时不能被凝胶介质稳定住。
2.聚焦时间不够。
3.聚焦后没有及时或没有充分固定。
4.在碱性侧可能是由于pH梯度的原因。
● 蛋白带丢失
1.蛋白浓度太低。
2.样品由于电泳时的温度或加样位置的pH而发生沉淀。
3.样品被吸附在加样滤纸上或加样滤纸孔径太小,分子不能进入凝胶。
4.加样位置太靠近等电点,或分子太大,或加样时场强太大,蛋白分子无法进入凝胶。
5.染色方法不灵敏。
6.染色前,蛋白分子没有被固定。
6.脱色时,蛋白分子被溶在脱色液中。
● 一些蛋白带聚焦在错误位置
1.蛋白分子形成复合物。
2.丢失配体。
● “一种”戴白聚焦成几条带
1.蛋白分子被解聚,被水解或形成复合物。
2.样品在准备,保存或电泳期间被氧化。
3.蛋白分子的寡聚物或部分基团的不同结合。
4.酶的不同程度的磷酸化作用,甲基化作用或乙酰化作用。
5.糖蛋白的糖残基不同。
6.样品在含有尿素时产生氨基甲酰化作用。
● “微笑”与“皱眉”现象
    “微笑”与“皱眉”现象同属于边缘效应
1.凝胶的边缘与中间的温度分布和电场强度不同。
2.放置一段时间后,凝胶边缘的浓度高于中间的浓度。
● 背景脱色不净
1.在固定后漂洗时,载体两性电解质没有被完全洗去。
2.染料质量不好,未充分溶解。
3.染色液浓度太大
● 凝胶和支持膜表面有染料沉淀
   染料沉淀来自于三氯醋酸和载体两性电解质的复合物。可在染色后,脱色前在脱色液中用湿棉花轻轻擦去。
● 凝胶从支持膜上脱落
1.三氯醋酸太浓,固定时间太长。
2.温度太高,真要太激烈。
3.支持膜质量不好。
● 蛋白带在染色和保存过程中丢失
1.改变染料,脱色液或染色方法。
2.降低保存液中甘油的浓度。
 
二、琼脂糖凝胶等电聚焦
● 凝胶强度不够
1.凝固时间不够。最好灌注后1小时取出凝胶,再在保湿盒中置4℃过夜。凝胶可保存一周。
2.浓度不够。琼脂糖应放在室温,密封保存,以防吸水。
3.尿素会破坏琼脂糖的结构,所以此时凝胶浓度最好为2%。
● 等电聚焦时凝胶表面有水
1.从冰箱中取出时,先用滤纸吸干凝胶表面的水。
2.凝胶凝固时间肽段。
3.电极液浓度太大,应该使用比据宾西酰胺凝胶等电聚焦时弱的酸和碱。
4.电极条上的电极液过多。
5.电内渗所致,必须使用无电内渗琼脂糖。
6.如果在考级阴极侧有水,是由于电内渗所致。
7.如果在加样位置有水,说明蛋白浓度太高,样品有盐,或加样滤纸有电内渗。
● 在加样位置有压痕
1.加样时电场强度太大。
2.过量加样。
3.凝胶强度不够。
● 等电聚焦时凝胶干掉
1.强电内渗使靠近阳极侧干掉。
2.凝胶厚度不均匀,薄的位置干掉。
3.空气太干燥。
4.电泳槽旁有热源。
● 打火花
1.凝胶干了。
2.电压过高。
3.凝胶表面有水。
● 蛋白带太宽
过量加样使邻近样品泳道混在一起。
● 蛋白带不细窄
1.聚焦时间不够。
2.聚焦时间过长,阴极漂移所致。
3.因为琼脂糖凝胶孔径大,易在等电聚焦时扩散。
● 蛋白带丢失
同聚丙烯酰胺凝胶的原因,且在碱性pH范围丢失带的现象更严重。
● “微笑”,“皱眉”和蛋白带偏斜现象
同聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的原因。
● 蛋白带的拖尾和纹理现象比使用聚丙烯酰胺凝胶时减轻,因为琼脂糖凝胶孔径大。
● 染色时的一些问题同聚丙烯酰胺凝胶,脱色比较容易。
 
 
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