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辉骏生物慢病毒包装技术答疑

1、  慢病毒载体系统包括了哪些质粒?
现在通常所用的慢病毒载体系统由4质粒组成,包括1个慢病毒表达质粒和3个包装质粒。其中,慢病毒表达质粒携带慢病毒必需的HIV-1长末端重复序列(LTRs)、包装信号(Ψ)以及能促进外源基因表达、病毒滴度和病毒整体功能的其它元件(WPRE、cPPT/CTS和RRE);3个包装质粒分别表达产生慢病毒包装必需的蛋白——Gag/Pol、Rev和VSV-G。

2、慢病毒的包装容量有多大?
慢病毒的包装容量约为10~10.5 Kb左右。去除约3 Kb的病毒骨架元件(LTRs、Ψ等),慢病毒载体的基因装载量约为7.0~7.5 Kb。由于启动子等调控元件、筛选所需的抗性基因/荧光基因仍需占据一定空间,所以慢病毒可容纳的外源基因片段不得超过4kb,否则将无法包装出慢病毒;并且外源基因越长,越难获得高滴度的病毒液(通常插入的片段在3kb以内)。

3、慢病毒对目的细胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?
首先要保证细胞在感染之前处于良好的生长状态,提前24小时在细胞板上铺好细胞。其次可以使用易感细胞如293T进行滴度测试,检测慢病毒浓缩液滴度是否出现大幅下降。在此基础上适当提高慢病毒感染的MOI值和延长感染时间。另外,还可以选择在培养基中添加polybrene或更换为Fitransfer培养基。

4、加入慢病毒后,目的细胞状态很差或出现大量死亡,原因是什么?如何解决?
慢病毒感染宿主细胞时可能引发细胞的毒性反应,如果所选择的宿主细胞对慢病毒感染很敏感,则会出现严重的生理异常或死亡。针对这种情况有以下几点解决方法:首先要在感染之前保证细胞处于良好的生长状态;二是要适当减少病毒用量,以降低细胞的毒性反应;三是要根据细胞反应,在感染后4~12h为细胞换液,并观察细胞的反应。

6、如何确定选择的宿主细胞能否被慢病毒感染?
在正式实验之前需要进行慢病毒感染预实验,即用空的带荧光标记的慢病毒来感染选定的宿主细胞,根据细胞是否可观察到荧光,来判断慢病毒对此靶细胞的亲嗜性。

7、稳定细胞株筛选的药物浓度如何确定?
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前,需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。对于一些常见的细胞系,通常可以在文献等资料中找到推荐的药物浓度。用G418或潮霉素B,选用在5天左右出现细胞大批死亡,2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。不同批次的药物活性有一定差异。因此在使用新批次药物时,需要重新测定最佳浓度。
 
 
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