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DIGE技术答疑

Q:荧光标记的原理是什么?
A:CyDye DIGE染料含有一个N-羟基丁二酰胺酯反应集团,该反应集团通过酰胺键与蛋白质赖氨酸残基的ε氨基共价结合。蛋白质中赖氨酸携带一个中性或酸性的固有一价正电荷,当CyDye DIGE染料与赖氨酸偶联后,CyDye DIGE 染料取代了赖氨酸的一价正电荷,从而保证了蛋白质的pI值不变。
 
Q:染料和蛋白质之间的比值不当对实验会有什么影响?
A:如果染料:蛋白质的比值过低,会降低标记效率,从而使检测敏感度降低;如果染料:蛋白质比值过高,每个蛋白质可能结合多个染料分子,进而可能在凝胶上形成复斑。
 
Q:为什么标记系统的pH需为8.5?
A:细胞裂解产物采用CyDye DIGE染料标记,最佳pH为8.5,低于最佳pH可能导致标记无效,高于最佳pH则标记反应可能出现不确定性。
 
Q:2D凝胶图像荧光信号弱的可能原因有哪些?
A:主要原因是标记效果不好。可能是染料与蛋白质比值不合适、标记系统pH未达到8.5、样品缓冲液或者标记体系中含有DTT等巯基试剂以及DMF试剂不纯等都会影响荧光标记的效果。
 
Q:荧光标记物是否会影响电泳结果?
A:CyDye DIGE染料包括3中光谱分开的可溶性染料(Cy2、Cy3和 Cy5),每种染料与蛋白质偶联后,蛋白质分子量增加450Da,质量变化并不影响第二向SDS-PAGE凝胶图像,采用任何的染料标记的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上都迁移到同样的位置,使得多路技术成为可能,。
 
Q:为什么DIGE中要设定一个内标混合样?
A:DIGE中要设内标就是为了消除系统误差和实验操作者所带来的误差。先是引入内标,消除系统误差,同一块凝胶上的两个不同样品都和内标进行比较,从而消除系统误差。接下来是所有不同批次的凝胶中的内标进行归一化(normalization)后,消除凝胶跟凝胶之间的系统误差。
 
Q:怎样才能做好DIGE实验
A:其实DIGE的基础是双向电泳技术,不过,DIGE用Cy染料对样品进行标记,而且设定了内标,使得定量结果更精确。所以,做好DIGE,必须先做好2DE
 
Q:DIGE图片扫描用的是什么仪器?
A:我们现在采用的是激光扫描仪Typhoon 9400(GE)
 
Q:DIGE分析差异斑点后,用什么型号的质谱仪进行斑点的质谱鉴定
A:我们采用ABI 4800质谱仪,属于MALDI-TOF/TOF类型质谱。
 
Q:为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白?
A:从生物学角度看,由于miRNA调控、蛋白降解、蛋白分泌、转录和翻译效率不一致等原因,导致蛋白水平和转录水平未必呈现一样的趋势,这是正常现象。
 

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