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辉骏iTRAQ技术答疑

Q: iTRAQ技术原理是什么?
A:多个(每组最多8个)来源不同的蛋白样品经过不同标签标记后,可以合并后同时进行质谱分析。一级质谱图上,相同m/z的肽段表现为同一个离子峰,但是其在二级质谱图上,破碎分为不同的报告离子和其他离子,相应每个样品的报告离子强度用以表征该蛋白在不同样品中相对含量的高低,而肽段碎片离子可用于蛋白的鉴定分析,是鉴定与定量同时进行的一种定量技术。
 
Q:不同客户的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机?
A:不能。如果客户的样品来自不同物种,那么质谱鉴定的数据库选择会不同,无法进行比较。如果是同一个物种的样品,那么经过不同实验室处理后,样品里的蛋白含量和数目会有较大差别,混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。
 
Q:iTRAQ技术区别与双向电泳技术相比,具有哪些优势?
A:1、灵敏度很高,检测限较低,可检测出低丰度蛋白;
2、高通量:同时对4-8个样本进行分析,提高实验通量,可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析;
3、分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定,包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白;
4、结果可靠:通过高度敏感性和精确性的串联质谱方法,不需要凝胶,即可获得相对定性与定量分析结果;
5、自动化程度高:液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。
 
Q:iTRAQ技术适用对象有哪些?
A:iTRAQ是在体外标记蛋白质,理论上讲所有物种、组织、细胞均可以采用iTRAQ技术。但是,iTRAQ成功鉴定蛋白质的数目比较依赖物种蛋白质数据库的齐全,要想鉴定的蛋白种类多,样品尽量是蛋白质数据库比较齐全的物种。
 
Q:关于“样品重复”,技术重复和上机重复有什么区别?
A:“样品重复”,也可以称为生物重复。生物重复是指样品来自同一处理组的不同样品,是整个实验的完全重复,如平行培养的细胞或细胞株。技术重复是指对同一生物样品进行重复实验,可降低实验中的测量误差或背景噪音。上机重复是指是指同一样品进行重复上机检测。
 
Q:iTRAQ技术一次性可以标记多少组样本?
A:iTRAQ的标记物有8种,一次实验最多标记8组样本。
 
Q:iTRAQ技术采用什么型号的质谱仪?
A: 我们采用的质谱仪是AB Sciex公司的Triple TOF 5600,属于LC-MS/MS
 
Q:iTRAQ 和SILAC两种技术的区别有哪些?
A:1、iTRAQ是一级质谱定性,二级质谱定量,实际操作中,一级质谱中m/z相近的一些母离子,而不是严格的同一m/z的母离子,被筛选进入质量分析器2进行二级质谱鉴定,定量的肽段与定性的肽段不是一一对应的关系,故造成iTRAQ定量误差大。然而,SILAC是一级质谱定量,二级质谱定性,定量的肽段就是对应的定性的肽段,定量更加精确。
2、iTRAQ在母离子进入质量分析器2前要进行母离子破碎,但是母离子破碎的比率达不到100%,造成报告离子的峰强偏低,定量存在误差。
 
Q:采用iTRAQ技术对样品有什么要求?
A:iTRAQ对于每一个样品的蛋白需求最少为50ug,采用4标标记进行的iTRAQ实验其同时分析的样品数量不能多于4个,采用8标标记进行的iTRAQ实验其同时分析的样品数量不能多于8个。
 

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