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GST pull down实验原理


GST pull down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上,与溶液中的目的蛋白相结合。可用来确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间的新的相互作用。先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上,再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育,这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后,再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来,即GST pull down产物。这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白,也可用质谱鉴定出未知蛋白。辉骏生物可制备GST融合蛋白,多种GST pull down蛋白互作方案供客户选择,100%保证GST融合蛋白沉降技术服务到成功发表文献。


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GST pull down实验详细步骤流程


gst pulldown实验详细步骤_GST-pull down实验技术服务外包_GST标签蛋白.jpg

图:GST pull down实验步骤流程





应用领域



GST pull down技术服务公司费用






GST pulldown应用背景


蛋白质是几乎所有生命活动的直接效应分子,并且在行使功能的时候往往不是单打独斗的,蛋白质之间经常形成复合体,并且在工作过程中还会不断的更换相互作用的伙伴,从而行驶不同的功能。因此,研究蛋白质的相互作用成为研究蛋白质功能和作用机制的最为重要的环节之一。


常见的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母双杂交、荧光双分子互补(BiFC)、荧光共定位等。


pull down技术将目标蛋白进行体外原核表达,使标签蛋白(GST或His等)与目标蛋白融合表达,借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来,可以不受抗体、物种限制,比较轻松的获得目标蛋白的结合蛋白,还可以通过外源同时表达目标蛋白和待测蛋白,确定它们是否发生直接的相互作用,但该方法无法得知体内真实的结合情况。


Co-IP技术采用目标蛋白的抗体捕获样本中的目标蛋白及其互作蛋白复合物,反应的是体内真实的生理结合,但是不能显示这些相互作用是直接还是间接的;另外合适的免疫共沉淀抗体是决定实验成功的关键,有些蛋白没有可用的IP抗体,无法进行内源性Co-IP实验;通过构建带标签的表达载体,使目标蛋白与标签融合表达,借助标签抗体可以完成Co-IP实验,但需要注意合适的转基因方法又是影响该方法成功的关键。


酵母双杂交技术是比较古老的一种技术,将目标蛋白和待测蛋白与GAL4 的两个结构域BD和AD融合表达,在酵母细胞中,2个蛋白的结合使得BD和AD在空间上靠近,从而激活报告基因lacZ的表达。但是由于受试蛋白都需要和 AD/BD 结构域形成融合蛋白,空间构象可能改变;另外假阳性率也比较高。


荧光双分子互补(BiFC)技术将目标蛋白和待测蛋白分别与GFP的两个片段融合表达,转染细胞后,2个蛋白的结合使得GFP两个片段空间上靠近,从而发出绿色荧光,该技术观测直观,操作简便,但空间分辨率大约 250nm,对于蛋白质相互作用来说依然是个相当远的距离,因此位置上靠近但并未结合的蛋白也可能显示阳性结果,假阳性率较高;另外该技术可以验证蛋白间的相互作用,但不能筛选未知互作蛋白。


荧光共定位技术依靠荧光确定蛋白质具有相同定位,用于辅助证明而非直接证明细胞内蛋白间的相互作用。


以上方法通常相互补充,多种方法共同确定蛋白质间的相互作用,也能更大程度的避免假阳性结果。





GST pull-down技术实验服务研究案例—客户文章解析


GST pull down实验服务公司

GYS2/p53负反馈环抑制HBV相关性肝细胞癌的肿瘤生长



研究背景


糖代谢异常是癌症的突出特征,作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中的糖原含量降低,并与患者总体生存情况不良相关。探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。



研究路线


RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调,并与患者不良预后相关
细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长
GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制
Co-IP和 GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能
CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体,GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化,稳定p53蛋白水平
荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子,通过p300介导的乙酰化,在转录水平上抑制GYS2
对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2




研究结论

本研究首次报道了HCC组织中糖原含量显著降低,并与不利的患者预后相关,这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。低表达的GYS2促进HCC细胞增殖而非迁移,并提供了两条独立的证据线来支持GYS2和p53之间的关系。一方面,GYS2与MDM2竞争结合p53,以稳定p53免于蛋白酶体降解;另一方面,p53以负反馈方式抑制GYS2表达和糖原含量。这些数据表明p53和GYS2可能通过平衡彼此的表达而在HCC中发挥功能。


gst-pull down实验步骤及结果分析



客户文献

Chen S.L. et al:  A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 2018. (IF=12.701).





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辉骏实力

辉骏GST pull down 实验外包技术服务


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辉骏生物提供的GST Pull down实验技术服务分为以下两种:


1. GST Pull down WB,用于体外检测诱饵蛋白与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用;

2. GST Pull down MS,用于体外筛选诱饵蛋白与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。


GST pull down检测服务

服务项目服务内容结果交付实验周期  
客户提供价格
GST pull down WB构建诱饵蛋白的GST原核表达载体(可选做)载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告约2周        

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、实验样本

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白和待测蛋白序列)

点击询价



原核表达诱饵蛋白并进行Western blot检测Western blot检测图4-5周
Western blot检测待测样本中的猎物蛋白Western blot检测图

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
pull down实验报告
Western blot检测Pull down产物中的诱饵蛋白和待测蛋白Western blot检测图
GST pull down  MS       
构建诱饵蛋白的GST原核表达载体(可选做)

载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

约2周      

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、实验样本

3、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白序列)

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GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(3组:实验组、空载对照组、裂解液对照组)
pull down实验报告
Western blot检测pull down产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
LC-MS/MS定性检测pull down产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周





GST pull down技术服务优势*辉骏生物

1
近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可
2
对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户情况提出合适的方案建议
3
自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线
4
自有蛋白质组学平台,对微量互作蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解
5
售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿






GST pull down实验服务样本要求


1. 送样量要求


样本类型

GST pull down WB建议送样量

GST pull down MS建议送样量

动物细胞3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组2g/组
植物叶片2g/组4g/组
植物根或果实4g/组
8g/组
菌体50ul菌体沉淀/组100ul菌体沉淀/组


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 


2. 样本保存和运输要求:


(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。

 




GST pull-down实验结果示例


GST pull down试验服务结果分析

gst pull down WB:Western blot检测图(阳性)


GST-pull down外包实验服务结果分析

GST Pull-down MS:Western blot检测图


GST pull down实验服务费用价格实惠质量高

GST pulldown MS:质谱检索表格(部分展示)





GST pull down实验服务客户文章


1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019,IF=9.727.
【研究内容】:前期研究表明,GYS2基因在HCC患者低表达,干扰GYS2基因表达导致肿瘤增殖转移。本研究通过融合表达GST-GYS2、His-p53、His-MDM2,并用GST-pull down方法,证实了MDM2与p53竞争性结合GYS2基因。相关的COIPChIP-qPCR等实验进一步阐明GYS2基因降低肿瘤增殖转移的机制。
使用相关技术: gst pulldown测定、GST-pull down质谱分析、GST标签蛋白


2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015,IF=14.467.
【研究内容】:Wnt/β-catenin信号在内皮细胞的血管生成活性中起重要作用。过表达实验表明,转录因子Bach1过表达可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反应和人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin靶基因的表达。Co-IP实验和gst pull-down分析表明,Bach1直接与TCF4结合,并减少β-catenin与TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血损伤后的血管生成的作用机制,为血管生成治疗或其他涉及Wnt/β-catenin通路异常调节的疾病提供了新的治疗靶点。
使用相关技术: GST 融合蛋白、GST pull-down实验、GST pull-down技术



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GST pull-down试剂盒



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GST pull-down试剂盒产品简介


辉骏生物的GST pull-down试剂盒能够高效调取GST融合蛋白在各类样本中的互作蛋白。在GST pull-down实验前,先通过基因工程技术手段将目标基因和GST基因序列连接起来,并导入大肠杆菌中进行原核表达和纯化,之后融合蛋白通过GST标签与固相化在载体上的GTH( Glutathione)亲和结合。接下来,当样本中与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。



GST pull down试剂盒组分


 试剂名称 体积 保存条件
 GST标签纯化树脂 1mL 4 ℃
 裂解缓冲液(PH 7.4) 40mL 4 ℃
 漂洗缓冲液(5×) 30mL 4 ℃
 洗脱缓冲液(PH 2.0) 1mL 4 ℃




GST Pull down试剂盒产品优势*辉骏生物


1、GST融合蛋白与树脂亲和力强,可以高效纯化目标蛋白及其互作蛋白;

2、适用范围广,可用于动物组织、细胞、植物组织、微生物等各种类型的样本;

3、操作简便,周期短。

gst pulldown试剂盒-操作简便-周期短-辉骏生物.png




GST pulldown试剂盒使用流程简述


1. 通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白;

2. 在细菌上清液中加入GST标签亲和纯化树脂,4 ℃孵育2 小时;

3. 将待测样本裂解液加入上述体系中,4 ℃孵育过夜;

4. 漂洗、洗脱得到目标蛋白及其互作蛋白复合物。



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