Label-free是一种非标记的定量蛋白质组学技术，不需使用同位素标签做内部标准，直接根据肽段质谱峰的强度对蛋白进行相对定量。

不同样本提取的蛋白质进行定量，取等量蛋白分别进行胰酶酶解，之后纯化的各组肽段分别做LC-MS/MS分析；采用特定软件检索原始质谱数据，解析出不同样本中各个肽段的定量信息，进而获得蛋白质在不同样本中的定性和定量信息

1、蛋白鉴定和定量；
2、差异蛋白的筛选和鉴定。

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对蛋白筛选与定量方面有独到见解，擅长针对客户情况提出合适的方案建议

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1.Hervé V. et al:Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration. The Plant Cell.2014，IF=9.618. 【研究内容】：木薯是热带地区最重要的块根作物，但木薯采后生理快速退化（PPD）是制约木薯商品化生产的主要原因。研究者建立了一种基于图像的PPD症状量化方法，并使用Label Free非标记定量蛋白质组学方法，在木薯根中鉴定出2600多个独特的蛋白质，其中近300个蛋白质在PPD过程中表现出显著的丰度调节。基于蛋白质组学数据、酶活性和脂质过氧化检测，最终确定谷胱甘肽过氧化物酶是降低PPD的候选药物。 使用技术：label free定量蛋白组分析、Label-free实验外包服务

2.Brian D.et al:Large-Scale Label-Free Comparative Proteomics Analysis of Polo-Like Kinase 1 Inhibition via the Small-Molecule Inhibitor BI 6727(Volasertib) in BRAF V600E Mutant Melanoma Cells. Journal of Proteome Research.2015，IF=4.074. 【研究内容】：Polo-like kinase1(Plk1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种人类癌症中过表达，对持续的致癌增殖至关重要。为了更好地了解Plk1信号转导机制，研究者利用Label Free非标记定量蛋白质组学方法，发现Plk1特异性抑制剂BI 6727处理人黑色素瘤A375细胞后，多个蛋白的表达发生了变化。此外，研究者还通过异质核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)确定了Plk1和p53之间的新关联，从而为Plk1在癌细胞存活中的作用提供了有价值的见解。 使用技术：label-free 质谱、Label free非标定量蛋白质组学、LabelFree定量实验检测

蛋白组/代谢组实验

❶ iTRAQ 定量蛋白质组学

❷ Label Free 实验检测服务

❸ LC-MS/MS 蛋白质谱鉴定

❹ DIA 全息扫描定量蛋白质
❺ 广泛靶向代谢组学

蛋白/核酸相互作用实验

❶ GST pull down

❷ RNA pull down

❸ DNA pull down

❹ Co-IP 免疫共沉淀

❺ TAP-MS串联亲和纯化

分子细胞生物学实验

❶ 基因调取/合成 (cDNA克隆)

❷荧光定量PCR (qPCR)

❸ 载体构建实验服务

❹miRNA靶基因验证
❺ 慢病毒包装

科研产品

❶ 哺乳动物细胞表达载体

❷ 人cDNA克隆库

❸ 慢病毒表达载体

❹ 慢病毒干扰载体

抗体工程服务

❶ 单克隆抗体测序

❷ 抗体从头测序

❸ 抗体表达服务

❹ 重组抗体表达

实验试剂盒

❶ RNA pull down 试剂盒

❷ GST pull down 试剂盒

❸ COIP 试剂盒

❹ Flag 试剂盒

辉骏实力

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中文标题：小分子抑制剂BI 6727对BRAFV600E突变黑色素瘤细胞Polo样激酶1抑制作用的大规模非标记比较蛋白质组学分析

发表期刊：Journal of proteome research

影响因子：4.074

运用技术：Label Free非标定量蛋白质组学 （由辉骏生物提供技术支持）

● 内容概述

Polo-like kinase1(Plk1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过调节有丝分裂的进入、进展和退出，在多种人类癌症中过表达，对持续的致癌增殖至关重要。本研究通过利用定量蛋白质组学策略来比较Plk1特异性抑制剂BI 6727处理后BRAFV600E突变黑色素瘤细胞的蛋白质组，利用无标记纳米LC−MS/MS技术在Q-Exactive上进行筛选，鉴定了20多个感兴趣的蛋白；并通过乳酸和NAD水平来评估与细胞代谢相关的降低。此外，研究中还发现了多个蛋白酶体亚基的下调，导致20S蛋白酶体活性显著降低。有关异质核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)的检测也进一步确定了Plk1和p53之间的新关联，从而为Plk1在癌细胞存活中的作用提供了有价值的见解。

● 研究路线

● 研究结果

1. BI 6727处理、蛋白质鉴定、定量和分析

为确定Plk1在黑色素瘤中的下游分子机制，研究者阐明了BI 6727抑制Plk1后人黑色素瘤细胞蛋白质组的定量变化。使用Label Free方法进行分析，为准确确定蛋白质比例，每种样本类型设置了三个以上的实验重复。该方法识别出1800多种蛋白质，其中343种被识别的蛋白质表现出显著的表达变化。

接下来，研究者使用Panther(通过进化关系进行蛋白质分析)来评估集体蛋白质的分子功能，并确定催化活性和结合是主要的蛋白质功能(图2C)。

2. BI 6727治疗改变多种代谢蛋白的表达

蛋白质组学分析结果表明，Plk1活性的抑制导致多种代谢蛋白的表达减少，包括苹果酸脱氢酶1(MDH1)、谷草转氨酶2(GOT2)和转酮醇酶(TKT)。此外，Western blot结果证实了乳酸脱氢酶A(LDHA)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)和乳酸脱氢酶B(LDHB)显著降低(图3A)。有趣的是，LDHA、LDHB和GPI均在糖酵解中扮演着重要的角色。推测Plk1的过表达可能有助于癌症相关的从线粒体氧化磷酸化OXPHOS向有氧糖酵解的转换。

为了评估Plk1抑制对有氧糖酵解的影响，研究者分别测量了细胞外乳酸的水平，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的水平，乳酸是葡萄糖分解的主要副产品，而NADH和NADPH是糖酵解和磷酸戊糖途径分解葡萄糖过程中产生的酶辅助因子。结果显示两个治疗组(25 NM和100 NM)的乳酸水平与对照组相比显著降低(图3C)。在BI-6727处理的细胞中，NADH和NADPH水平显著降低，几乎降低了5倍(图3D)。这些数据表明，Plk1抑制后NAD+的下降幅度更大，鉴于丙酮酸到乳酸的转化是NAD+再生的主要途径，有理由预测LDHA的下降是比率变化的主要因素。

3. BI 6727治疗导致多个20S蛋白酶体亚基下调

 泛素-蛋白酶体系统通过一个系统过程对细胞内80%~90%的蛋白质降解起着不可或缺的作用。在比较蛋白质组学分析中，研究者发现BI6727治疗导致人黑色素瘤细胞中多个20S亚基的显著下调。进一步扩大IPA分析范围，发现20S亚基α7和β6分别下调了2.46%和5.56%(图4B)。使用荧光团标记的蛋白酶体底物检测了20S蛋白酶体的活性，检测显示，与对照组相比，BI 6727处理细胞的20S活性显著降低(图4D)。

4. 异质性核糖核蛋白C1/C2在BI 6727治疗后上调

异质性核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)是一种普遍存在的RNA结合蛋白，主要以hnRNPC1和hnRNPC2两种异构体表达。最近的一项研究表明，HNRNPC过表达通过抑制有丝分裂蛋白极光激酶B(AurkB)在肝细胞癌(HCC)细胞中诱导微核。Plk1活性的抑制可能会对AurkB的表达产生负面影响，与Plk1抑制相关的有丝分裂可能部分通过HNRNPC和AurkB介导。此外，HNRNPC被证明通过直接与p53 mRNA 5‘编码区的顺式元件结合来促进p53的翻译。研究者分别通过Western blot和p21的转录分析发现p53蛋白的表达和活性相应地增加(图5E)。这些数据为Plk1通过调节HNRNPC介导的p53表达提供了令人信服的证据。

● 结论

对BI 6727抑制人黑色素瘤A375细胞Plk1的蛋白质组学研究发现，多个蛋白的表达发生了变化，这些蛋白尚未被确定为Plk1信号网络的一部分。蛋白质组学分析提供了Plk1和HNRNPC之间一种新的关系的证据，并且Plk1抑制对厌氧糖酵解和蛋白酶体活性有相当大的影响，这两条途径是癌细胞生存所必需的。这些数据为新的Plk1信号通路和未来靶向治疗的潜在候选者提供了坚实的基础。