iTRAQ蛋白质组学 * 技术原理

iTRAQ（Isobaric tag for relative and absolute quantitation）是由美国AB SCIEX公司研发的体外同重同位素标记的定量技术。该技术采用8-plex标记试剂，可以同时比较8组样本之间的蛋白表达差异。iTRAQ的8种同位素标记试剂由报告基团（113、114、115、116、117、118、119、121）和平衡基团（192、191、190、189 、188、187、186、184 ）及肽反应基团组成。不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配后，相对分子质量均为305，即等量异位标签。iTRAQ同位素试剂标记多肽氨基基团后，等量混匀多肽并进行LC-MS/MS分析。一级质谱中，不同样品来源的同一肽段表现出相同的质荷比；二级质谱中，化学键断裂释放出报告离子，低质量区的报告离子强度反映了该肽段在不同样品中的相对表达量，高质量区的肽段碎片离子质荷比反映了该肽段的序列信息。质谱原始数据经过数据库检索，即可得到样本中所含蛋白及其表达差异。

iTRAQ蛋白质组学 * 实验流程

iTRAQ蛋白质组学 * 技术应用

基础医学：疾病标志物，发病机制，疾病分型等；

生物医药：药物机理，药效评价，药物开发等；

农林畜渔：抗逆胁迫，生长发育，耐药，致病机理等。

iTRAQ蛋白质组学 * 辉骏服务优势

1

十年服务经验，客户成果发表在NatureMethods，Oncogene，Cell Research等高水平期刊上。

2

对蛋白筛选与定量方面有独到见解，擅长针对客户情况提出合适的方案建议。

3

自有分子及细胞生物实验平台，能有效制定并执行最优的实验路线。

4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章，确保客户安心进行下游实验及投稿。

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iTRAQ蛋白质组学 * 服务信息

iTRAQ蛋白质组学 * 分析结果示例

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iTRAQ蛋白质组学 * 客户文献

1. Li K. et al: Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway. Ann Rheum Dis. 2018，IF=14.299. 【研究内容】：骨关节炎和软骨退变过程中，WNT/β-catenin被激活的机制尚未完全明确，本研究利用iTRAQ蛋白质组学技术，筛选了年轻（2月龄）和老龄（12月龄）小鼠的蛋白表达差异，并发现一种在老年软骨中强烈上调的蛋白——酪氨酸激酶Fyn。为了探究Fyn促进骨关节炎发展的机制，客户将免疫沉淀（IP）与蛋白质组学分析相结合，最终证明酪氨酸激酶Fyn可以通过激活β-catenin通路促进关节炎，为骨关节炎提供了一个新的治疗靶点。 使用技术：iTRAQ蛋白质组学分析、iTraq实验外包服务

2. Wu X.S. et al: Ubiquitin-specific protease 3 promotes cell migration and invasion by interacting with and deubiquitinating SUZ12 in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2019，IF= 7.068. 【研究内容】：泛素特异性蛋白酶3 (USP3) 的异常表达可能在肿瘤发展中起重要作用，然而其促进胃癌转移的机制尚不明确。本研究利用itraq蛋白质组学技术鉴定了USP3过表达胃癌细胞与对照细胞之间差异表达的蛋白质，发现SUZ12对于USP3介导的胃癌活性是不可或缺的，USP3结合SUZ12，去泛素化SUZ12并使其稳定。SUZ12敲除抑制USP3诱导的迁移、侵袭和EMT。结果表明USP3-SUZ12信号通路促进胃癌发展。   使用技术：itraq定量实验、itraq定量蛋白组学检测

4. Zeng L. et al: Asparagine Synthetase and Filamin A Have Different Roles in Ovarian Cancer. Front Oncol. 2019，IF=4.848. 【研究内容】：临床上早期卵巢浆液性癌较难发现，而高级别浆液性癌(HGSC)和低级别浆液性癌(LGSC)的蛋白表达谱将为诊断和化疗提供重要信息。研究者通过iTRAQ技术对13例HGSC和7例LGSC患者的标本进行了蛋白质组学分析，共鉴定出323个差异表达的蛋白质。IHC验证后，选择天冬酰胺合成酶(ASNS)和细丝蛋白A(FLNA)进行进一步的功能研究。体内和体外实验结果表明，ASNS和FLNA是HGSC和LGSC的不同的生物标志物，可能对浆液性癌的预后和临床治疗有潜在的价值。 使用技术：itraq分析、itraq差异蛋白实验

蛋白组/代谢组实验

❶ iTRAQ 定量蛋白质组学

❷ Label Free 实验检测服务

❸ LC-MS/MS 蛋白质谱鉴定

❹ DIA 全息扫描定量蛋白质
❺ 广泛靶向代谢组学

蛋白/核酸相互作用实验

❶ GST pull down

❷ RNA pull down

❸ DNA pull down

❹ Co-IP 免疫共沉淀

❺ TAP-MS串联亲和纯化

分子细胞生物学实验

❶ 基因调取/合成 (cDNA克隆)

❷ 荧光定量PCR (qPCR)

❸ 载体构建实验服务

❹ miRNA靶基因验证
❺ 慢病毒包装

科研产品

❶ 哺乳动物细胞表达载体

❷ 人cDNA克隆库

❸ 慢病毒表达载体

❹ 慢病毒干扰载体

抗体工程服务

❶ 单克隆抗体测序

❷ 抗体从头测序

❸ 抗体表达服务

❹ 重组抗体表达

实验试剂盒

❶ RNA pull down 试剂盒

❷ GST pull down 试剂盒

❸ COIP 试剂盒

❹ Flag 试剂盒

辉骏实力

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中文标题：酪氨酸激酶Fyn通过激活β-连环蛋白途径促进骨关节炎

发表期刊：Ann Rheum dis

影响因子：14.299

发表时间：2018年

合作单位：南方医科大学

运用技术：TMT标记定量蛋白质组学分析（由辉骏生物提供技术支持）

● 研究背景

骨关节炎(OA)是一种年龄相关性或创伤后退行性关节疾病，其确切的发病机制仍不明确。目前OA尚无有效的疾病修饰治疗方法，迫切需要开发新的治疗药物。因此，了解控制软骨细胞肥大和调控细胞外基质降解相关基因表达的机制对于开发有效的OA治疗方法具有重要意义。

● 研究路线

● 研究结果

1. Fyn在老年小鼠、创伤后骨性关节炎小鼠和人类骨性关节炎的关节软骨中聚集

研究者首先选取年轻(2个月)和老年(12个月)小鼠的关节软骨来识别与软骨退化有关的蛋白质。其中酪氨酸激酶Fyn是老年软骨中表达最强的蛋白(图1A)。对4、13和24月龄小鼠的关节软骨进行Western blotting分析，证实了老化软骨中Fyn的显著增加(图1B)，Fyn的积累伴随着老年小鼠软骨的退化和OARSI分级的增加(图1C，D)。为了确定Fyn在人OA关节软骨中的表达是否升高，研究者比较了接受过全膝关节置换术的老年OA患者（年龄67.00±3.03岁)软骨和无关节炎病史的年轻交通事故患者(30.25±8.18岁)的正常软骨中Fyn的表达。免疫荧光分析发现，老年组和OA组软骨细胞中Fyn水平明显升高，同时OA组软骨结构发生变性和丢失(图1E，F)。这些结果表明，Src激酶家族成员Fyn在老年小鼠和OA患者的退变和损伤的关节软骨中聚集。

图1

2. Fyn基因缺失阻止小鼠创伤后和衰老相关OA的发生 

为了确定Fyn在退变或受损软骨的关节软骨细胞中积聚的意义，研究者进行了Fyn基因敲除实验。Western blotting分析显示了8周龄小鼠软骨中Fyn基因的缺失(图2A，B)。与对照组相比，基因敲除组（Fyn-KO小鼠）关节软骨或生长板的形态和组织均没有明显差异，这表明Fyn基因的缺失没有引起小鼠骨骼发育异常。与对照组相比，Fyn-KO组小鼠的软骨中的蛋白质含量显著减少，TUNEL染色显示Fyn-KO小鼠关节软骨细胞凋亡明显减少(图2G)，软骨降解程度有所降低。这些结果表明，Fyn的缺失有效地阻止了小鼠创伤后和年龄依赖性OA的发展。

图2

3. Fyn与软骨细胞中的β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其稳定

为了探讨Fyn促进OA发生的机制，研究者通过蛋白质组学的方法对软骨前体细胞系ATDC5中与Fyn相互作用的蛋白进行了鉴定，在纯化的复合物中发现β-catenin可能是FYN的潜在互作伙伴(图3A)。IP分析证实β-catenin与Fyn在ATDC5细胞(图3B)、原代软骨细胞和软骨组织中存在相互作用。β-catenin和Fyn的双重染色也显示β-catenin与Fyn在ATDC5细胞中共定位(图3C)。为了确定Fyn是否磷酸化软骨细胞中的β-catenin，研究者在ATDC5细胞中进行了体外Fyn激酶检测。结果显示，Fyn免疫沉淀使β-catenin在体外Tyr142处磷酸化，这种磷酸化被Fyn激酶抑制剂PP1或AZD0530抑制（图3D）。此外，β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表达通过Fyn SiRNA被显著下调(图3E)，但在ATDC5细胞中通过Fyn编码质粒的Fyn过表达而增强(图3F)。为了验证Fyn在β-catenin信号通路中的关键作用，研究者在ATDC5细胞中检测了钙粘附素-catenin复合体的形成。PP1对Fyn的抑制或siRNA下调Fyn的表达可以稳定钙粘连蛋白-连环蛋白复合体，而Fyn的过度表达则破坏了该复合体(图3H)。这些数据表明，Fyn与β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其稳定，导致软骨细胞中钙粘连蛋白-catenin复合体的解离。

图3

4. Fyn激活β-catenin途径促进OA的发生

在Fyn和β-catenin的双重染色中发现，随着Fyn水平的增加，β-catenin从细胞膜转移到了细胞核(图4A)。用促炎因子白细胞介素1β(IL-1β)处理ATDC5细胞，诱导Fyn和β-catenin在细胞浆和细胞核中的积聚(图4B)，并增加Fyn的表达和磷酸化水平(Tyr416)，β-catenin的表达和磷酸化水平(Tyr142)，以及MMP13的表达(图4C)。接下来，研究者评估了老年小鼠和创伤后OA小鼠软骨中β-catenin及其磷酸化的水平。结果显示，β-catenin及其磷酸化水平随着年龄的增长和OA的加重而增加(图4D)。此外，创伤后FYN-KO小鼠关节软骨细胞中的β-catenin水平及其核定位明显低于对照组(图4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途径的激活剂。Fyn的敲除实验显示，在OA的发生发展过程中，Fyn激活了不依赖Wnt信号的β-catenin通路，并增强了β-catenin在关节软骨细胞中的核转位。关节注射icg-001明显减少了软骨损伤，维持了关节软骨中蛋白多糖的含量，并降低了OA发生过程中的关节炎分级，退变软骨中MMP13和ADAMTS5的表达水平也相应降低。这些结果表明，β-catenin通路参与了Fyn刺激软骨细胞MMP13和ADAMTS5的表达以及小鼠OA的发生与发展。

图4

5. FYN抑制剂AZD0530和PP1抑制β-catenin信号转导并阻止小鼠骨性关节炎的发生

为了研究Fyn作为OA治疗靶点的潜在用途，研究者检测了Fyn的化学抑制剂在OA的发病和进展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的选择性抑制剂，可用于癌症的治疗。注射小鼠后，与赋形剂治疗的小鼠相比，AZD0530和PP1治疗显著减少了软骨的破坏(图5A)、OARSI分级(图5B)和滑膜炎症，MMP13、ADAMTS5和X胶原含量、TUNEL阳性软骨细胞数和骨钙素表达也显著减少(图5C，D)。这些结果表明，抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠创伤后骨性关节炎的发生。Western blotting显示AZD0530或PP1可阻断IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上调，并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加（图5E）。接下来，研究者检测了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治疗的创伤后OA小鼠的软骨样本中p-β-catenin(Tyr142)的表达。结果显示，AZD0530和PP1处理的小鼠，MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表达均明显降低(图5F)。此外，用AZD0530或PP1治疗OA时，Fyn和β-catenin在软骨细胞核中的共存也被取消(图5G)。这些结果表明，AZD0530和PP1通过抑制FYN诱导的磷酸化β-catenin的表达来预防OA的发生。

图5