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研究人员引入CRISPR介导的基因组和癌症粉碎作为治疗复发性胶质瘤的概念范例
发布时间:2023-12-02 14:03:07作者:辉骏生物-fitgene

在最近发表在Cell Reports上的一项研究中,研究人员证明了成簇的定期散布的短回文重复序列(CRISPR)介导的胶质母细胞瘤(GBM)细胞的消除。


原发性胶质母细胞瘤是一种侵袭性肿瘤,治疗具有挑战性,尽管采用多种治疗方案,其中位生存期为12至15个月。研究已经表明广泛的肿瘤内异质性,细胞亚群表现出不同的基因表达模式、突变、表观遗传状态和拷贝数畸变,这也使得靶向特定分子过程的治疗无效。


替莫唑胺(TMZ)是目前治疗GBM的一线化疗药物,对TMZ的敏感性取决于O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子的甲基化。虽然基于TMZ的治疗可以提高生存率,副作用较少,但大多数患者都会经历疾病进展。


TMZ还增加了体细胞突变率,并与DNA错配修复(MMR)途径的丢失和肿瘤基因组不稳定性相结合,导致超突变。目前,对于高度突变的神经胶质瘤没有有效的治疗方法。因此,迫切需要消除GBM细胞的疗法,无论其突变谱如何。


在本研究中,研究人员引入了基因组/癌症脱落,这是一种基于CRISPR的治疗策略,通过靶向肿瘤基因组中的独特重复序列来治疗原发性/复发性GBM。首先,他们将患者的原发性和复发性GBM与其天然基因组进行了比较。患者接受手术切除,辅助放疗和TMZ化疗,并在11个月后复发。


肿瘤突变负荷的定量显示,原发性和复发性GBM的突变中位数分别为123和217个/兆碱基,均归类为高突变。在原发性和复发性GBM中,分别有超过4400和11600个蛋白质编码突变和451484和698557个非编码基因组突变。


研究人员计算了患者天然基因组以及原发性和复发性GBM中可能的化脓性链球菌CRISPR相关9(Cas9)单向导RNA(sgRNA)。在该靶空间中可能存在数亿个sgRNA,称为“sgRNA-ome”,其中大部分具有多个靶基因座。研究小组将这些具有重复靶位点的sgRNA称为sgCIDE(用于通过编辑CRISPR诱导的死亡)。


接下来,他们选择了前10个sgCIDE,具有3000至300000个靶位点,以评估CRISPR-Cas9通过靶向重复序列消除GBM的能力。Cas9和10种sgCIDE在LN-229和U-251 GBM细胞中的稳定表达引起稳健和快速的细胞消耗,而表达非靶向sgRNA的那些细胞不消耗。


表达Cas9的细胞在用sgCIDE转导后24小时显示出广泛的基因组片段化。此外,实时定量活细胞成像表明,sgCIDE在转导后第1天引起生长抑制,并在第2天引起细胞死亡。接下来,研究小组在TMZ敏感和耐药GBM中测试了基因组破碎。


将表达Cas9的TMZ抗性LN-18和T98 G以及TMZ敏感性LN-229和U-251 GBM细胞用TMZ处理或用含有sgCIDE的慢病毒载体转导。细胞活力定量显示TMZ剂量滴定的预期效应,仅在TMZ敏感细胞中有明显的致死性。相比之下,sgCIDEs的表达在所有四种细胞系中引起病毒滴度依赖性致死性,与MGMT启动子的甲基化状态无关。


集落形成测定显示,相对于二甲亚砜(DMSO)处理的细胞,TMZ处理的U-251细胞中的集落减少一到两个对数尺度,而用sgCIDE转导观察到集落减少两到三个对数尺度。然而,一些sgCIDE转导的细胞存活并形成集落。


建立了这些逃逸克隆的单克隆细胞系,并开发了表达sgRNA和mCherry或编码sgRNA和mCherry标记的Cas9的一体化版本的慢病毒载体。用仅提供新sgRNA的载体再处理逃逸克隆未能引起细胞耗竭,而用一体化载体再处理导致有效的细胞消融。


其他研究表明,有效消除细胞所需的最小DSB数量对于完全互补的靶位点为30个,对于具有单个错配的靶位点为70个。由于基因组粉碎的靶点也存在于正常基因组中,研究人员推测,高度突变的胶质瘤中的癌症特异性突变可能具有独特的序列,可以用于癌症特异性基因组粉碎(癌症粉碎)。


复发性GBM显示出高度突变GBM的特征性TMZ突变特征(升高的胞嘧啶至胸腺嘧啶转化)。接下来,研究小组使用复发性GBM衍生的细胞系来评估TMZ突变特征是否可以用于特异性靶向和细胞消融。这种患者来源的细胞系(PDCL),命名为SF 11411,具有与其他GBM细胞系相似的基因组破碎敏感性。


研究人员确定了10种重复的sgRNA,这些sgRNA对复发性肿瘤是独特的。为了验证,该团队在正常人类星形胶质细胞(NHA)和PDCL SF 11411中进行了大规模CRISPR筛选。CRISPR文库包括(约5000个)在单个基因座或多个基因座处靶向非编码和编码基因组的指导、sgCIDE、非靶向对照和安全港参考。


使用下一代测序来比较NHA,并且在转导后第1天和第28天用CRISPR文库以单拷贝转导PDCL细胞。如预期的,大多数sgCIDE在两种细胞系中耗尽。非靶向对照在两种细胞系中具有中性效应,而癌症特异性重复sgRNA仅在SF11411中耗尽,但在NHA中富集。


该研究描述了CRISPR介导的基因组/癌症粉碎治疗复发性胶质瘤。癌症粉碎依赖于靶向重复的肿瘤特异性基因座,触发CRISPR介导的基因组片段化和DNA损伤诱导的细胞死亡。此外,基因组破碎与TMZ敏感性和GBM细胞的表观遗传状态无关。


大多数细胞屈服于最初的DNA损伤,罕见的逃逸者可以有效地重新治疗。肿瘤特异性重复序列的存在使得能够通过靶向治疗诱导的突变特征来切割癌症。总的来说,这些发现为开发癌症特异性疗法以治疗高度突变的胶质瘤和其他高度突变的癌症提供了潜在的途径。


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