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Zhou D.H. Comparative proteomic analysis of virulent and avirulent strains of Toxoplasma gondii reveals strain-specific patterns

中文标题:弓形虫毒力和无毒菌株的比较蛋白质组学分析揭示了菌株特异性模式

发表期刊:Oncotarget

影响因子:5.168

发表时间:2017年7月

合作单位:中国农业科学院兰州兽医研究所

运用技术:iTRAQ蛋白质组学分析(由辉骏生物提供技术支持,点击查看服务详情)



● 研究背景

顶端复合体原生动物寄生虫弓形虫具有感染多种哺乳动物、鸟类和人类的显著能力,近年来,人们对弓形虫卵囊的兴趣与日俱增,因为其在弓形虫传播到新的宿主和生态系统中起着重要作用,而且与海洋哺乳动物感染和人类水源性疫情有关。弓形虫表现出高度的遗传多样性,包括具有不同毒力潜力的菌株。尽管近年来在了解不同基因型弓形虫不同致病行为的分子基础方面取得了重大进展,但有关感染结局差异的机制尚不完全清楚。

 

之前的研究发现了三个弓形虫克隆系,它们在小鼠中表现出不同的毒力表型,其中I型株对小鼠是致死的,而III型株和III型株的毒力较低。此外,卵囊孢子形成过程中发生的蛋白质组学变化已有相关报道,然而,对促进不同基因型菌株毒力的差异表达蛋白的了解仍然有限。

 


● 研究结果

1. 蛋白质的鉴定与表达

研究者通过iTRAQ的蛋白质组学方法分析了弓形虫卵囊中强毒株Pys和弱毒株PRU之间的蛋白质组学差异,共鉴定出2551个蛋白(图1)。两个生物副本的系统聚类分析结果如图2所示,COG聚类分析将鉴定的蛋白质分为26个类别。如图3所示,翻译、核糖体结构和生物发生;翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣;一般功能预测;信号转导机制;以及能量产生和转换是识别最多的五类蛋白质。

 

研究者通过比较Pys株和PRU株的相对蛋白质表达值来鉴定差异蛋白。结果显示共有374个蛋白质被归类为差异蛋白,其中192个蛋白质增加,182个蛋白质减少;GTP结合蛋白LEPA(TGME49_307980)、弓形虫D家族蛋白(TGME49_271590)、TGME49_294600、TGME49_205090和毒物霉素(TGME49_214080)是增加最多的5个蛋白,相反,减少最多的5个蛋白分别是致密颗粒蛋白GRA7(TGME49_203310)、TGME49_203890、杆状蛋白ROP5(TGME49_308090)、含锌酒精脱氢酶(TGME49_311780)和纽迪克斯型基序9异构体家族蛋白(TGME49_247220)。

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  图1

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  图2

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  图3


2. DEP的功能注释                                                                                        

为了阐明Pys和PRU菌株卵囊中差异蛋白的生物学作用,研究者使用GOseq R软件包进行了GO富集分析。分析将差异增加和减少的GO蛋白分为生物过程、细胞组成和分子功能三大类,这三个类别中最丰富的前10个GO术语分别针对增加和减少的蛋白质(图4A-4B)。生物过程中蛋白质增加的前五个富集GO术语包括小分子代谢过程、细胞蛋白修饰过程、生物合成过程、细胞氮化合物代谢过程和翻译过程。相应地,蛋白质降低的前五个过程分别为细胞蛋白质修饰过程、细胞氮化合物代谢过程、生物合成过程、碳水化合物代谢过程。iTRAQ蛋白质组学分析、itraq实验服务、iTRAQ技术.png

图4

 

细胞成分类别中增加的前三个术语包括细胞内、细胞质和蛋白质复合体,而减少的前三个术语包括胞外区、细胞质和细胞。在分子功能类别中,离子结合项是GO项最显著富集的项。KEGG途径富集分析显示164个差异蛋白具有KEGG正畸(KO)ID,与51条途径相关。图5显示了27条高度富集的途径。其中最显著富集的10条途径是代谢途径、次生代谢物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代谢、氨基酸的生物合成、柠檬酸循环(TCA循环)、过氧化物酶体、核糖体、丙酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解。

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图5


3. 毒力因子表达的差异

弓形虫卵囊的许多毒力因子在孢子形成过程中增加,这与孢子化卵囊的感染性有关。本研究中,研究者检测到了PYS和PRU菌株的孢子化卵囊之间这些毒力蛋白表达水平的差异。在PYS菌株和PRU菌株的孢子化卵囊中常见的22种毒力蛋白中,只有丝氨酸-苏氨酸磷酸酶2C(PP2C)和rhoptry蛋白ROP16(ROP16)在PRU菌株中具有更高的表达水平。相比之下,13种毒力因子包括GRA6,RON4,MIC3,ROP2A,GRA1,RON5,ROP18,MIC2,顶膜抗原AMA1,MIC4,MIC6,ROP5和GRA7在PYS菌株中上调。此外,ROM4,VP1,SPA-TR,MIC1,PHIL1,MIC8和RON2等七种毒力蛋白的表达水平在两种菌株之间没有显示出任何显着差异(图6)。这些结果表明,毒性PYS菌株的孢子化卵囊比毒性较低的PRU菌株的孢子化卵囊表达更多的毒力因子。

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图6

 

4. 卵囊壁蛋白的表达

卵囊壁蛋白在弓形虫卵囊的环境耐受性中起着重要的作用,可以保护子孢子免受外界环境和宿主内部不利条件的影响。研究者鉴定了22个卵囊壁蛋白,并分析了它们在弓形虫卵囊两个不同基因型变异体之间的差异表达,结果显示,卵囊壁蛋白增加了10个,减少了3个。大约一半的卵囊壁蛋白在PRU卵囊中的表达水平高于Pys卵囊。与PRU卵囊相比,Pys卵囊中只有3种卵囊壁蛋白过表达。其他9种卵囊蛋白在两株寄生虫之间无显著差异。这些卵囊壁蛋白表达的差异可能与Pys品系和PRU品系卵囊在环境中生存能力的差异有关。

 


5. 蛋白质-蛋白质网络的构建

研究者使用Cytoscape软件构建差异蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络(图7)。相互作用的程度被定义为确定一个节点与之直接相连的邻居的数量,与其他蛋白质高度相互作用的节点被定义为“HUB”蛋白。其中重要的HUB蛋白是肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)、GMP合成酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(G6PD)和柠檬酸合成酶(CS)。这些蛋白都在各种代谢过程中起着重要作用。例如,IMPDH和GMP合成酶是合成鸟嘌呤核苷酸的关键酶,被认为是很好的治疗靶点;同样,G6PD和线粒体CS在糖酵解和碳水化合物代谢中起作用。这四种HUB蛋白的qPCR验证结果与蛋白质组学数据一致(图8)。Pys品系的G6PD和GMP表达水平低于PRU品系,IMPDH和CS表达水平高于PRU品系。

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图7

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图8

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