免疫沉淀质谱（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）是研究蛋白质相互作用、揭示蛋白质作用机理的重要研究方法。基于液质联用质谱（LC-MS）的蛋白鉴定，在多个科研领用中有着广泛应用，可以对目标蛋白、蛋白混合物或相互作用蛋白进行鉴定。

其在蛋白研究中应用如下： （1）筛选目标蛋白未知互作蛋白时：通过IP捕获“目标蛋白-结合蛋白”复合物，质谱可获得复合物中蛋白鉴定列表； （2）确认目标蛋白存在方面：①在非编码RNA翻译蛋白研究中，IP捕获样本“预测目标蛋白”后，质谱验证其存在性；②在蛋白表达研究中，则通过IP捕获体外/体内表达的目标蛋白，质谱确认表达情况； （3）鉴定目标蛋白修饰位点时：IP捕获样本中目标蛋白，质谱可精准鉴定其修饰肽段及位点。

辉骏生物将为您介绍Co-IP方法制备的样品进行蛋白鉴定的全流程方案。 

01  实验原理

 蛋白质被酶解成肽段，进入质谱仪，被离子化而带上电荷，检测得到各肽段的质荷比（m/z），即一级质谱数据；肽段在质谱仪中被进一步破碎，得到各肽段碎片离子的质荷比（m/z），即二级质谱数据。用检索软件比对相应的蛋白数据库，对质谱原始数据进行解析，导出蛋白的定性和定量数据。

图1 IP-MS基本原理示意图 

02  实验步骤 

实验大致流程：总蛋白提取→总蛋白与抗体孵育→proteinA/G磁珠与抗体结合→蛋白洗脱（变性/非变性）→质谱测序→数据分析

1 总蛋白提取

（1）培养目标细胞，待细胞生长至合适密度，收集细胞；

（2）用预冷PBS缓冲液清洗细胞2-3次，加入300-500 μL预冷的IP裂解缓冲液（辉骏货号为：FI8101），在IP裂解液中预先加入3-5 μL蛋白酶抑制剂（辉骏货号为：FI8105），现用现配；

（3）4℃混匀仪上裂解30 min；

（4）为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清；如果无超声条件，可置于冰上裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5 s；

（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

2 总蛋白与抗体孵育

（1）将余下蛋白样本平分为IP实验组、IP对照组，实验组加入目标蛋白的IP级别抗体，对照组加入Normal IgG抗体（与实验组抗体同源同型）；

（2）4℃孵育4 h或过夜。 

图2 内源性蛋白Co-IP实验分组图

3 proteinA/G磁珠与抗体结合

（1）磁珠预处理：每组取25 μL proteinA/G磁珠（辉骏货号为：FI8302），加入200 μL漂洗缓冲液（辉骏货号为：FI8107），颠倒混匀30次； 

（2）放磁力架上静置1 min，弃上清；

（3）重复上述洗涤步骤1次；

（4）向磁珠中加入蛋白样本/抗体复合物，充分混匀，置于4℃混匀仪上孵育2 h；

（5）放磁力架上静置1 min，弃上清，加入500 μL漂洗缓冲液，颠倒混匀30次； 

（6）放磁力架上静置1 min，弃上清，重复上述洗涤步骤2次。

4 蛋白洗脱

4.1 变性洗脱 

（1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱，振荡混匀后瞬离，95℃加热5-10 min；

（2）放磁力架静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，进行上样跑SDS-PAGE胶；

（3）将SDS-PAGE胶使用考染（MS效率更佳）或银染（灵敏度更高），一般选择考染；

（4）切胶条后可送辉骏生物进行质谱（MS）检测。

4.2 非变性洗脱 

（1）向磁珠中加入40-50 µL洗脱缓冲液（辉骏货号为：FI8102），涡旋振荡20 s，放混匀仪上室温洗脱10-15 min，涡旋振荡20 s；

（2）1000 g离心20 s，放磁力架上静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脱后的蛋白可直接送辉骏生物进行质谱（MS）检测。

5 质谱测序

通过质谱（MS）技术对IP洗脱液中的蛋白成分进行鉴定和分析，筛选诱饵蛋白的未知互作蛋白。

6 数据分析

找到关键hub蛋白。

 03  送样建议 

1 只鉴定特定目标蛋白

根据WB结果切对应SDS-PAGE胶上目标位置的条带，避免切到其他条带或空白胶。

2 鉴定产物中的全部蛋白

（1）非变性洗脱：酸性洗脱或竞争肽洗脱，洗脱液直接进行液态酶解和质谱；

（2）变性洗脱：①Loading buffer煮beads，跑胶再全泳道做质谱（因为加了loading buffer的溶液没办法直接液态酶解）；②加PBS煮样5-10 min洗脱蛋白，洗脱液可以液态酶解。

3 三种不同的洗脱方法，如何选择？送溶液好还是胶条好？液态酶解的肽段回收率高于胶内酶解，因此首选非变性洗脱或PBS煮样洗脱送样。但如有以下情况，可以选择跑胶做质谱：

（1）溶液样品中含有不易去除且质谱不兼容的物质，比如溴酚蓝、高比例甘油、高浓度离子型去污剂（SDS）等；

（2）有严重轻重链污染，可以跑胶后切除高丰度条带；

（3）非变性洗脱率较低，洗脱产物的SDS-PAGE几乎无条带。

* 注意：（1）胶块较大或条带较多时，需要先将胶切成几份，再分别酶解；（2）充分酶解能够提高肽段回收率，增加蛋白鉴定数量，但会因此增加酶解费用；（3）如果想降低成本，可以减小胶块体积，例如跑较短的胶（1-2 cm）或浓缩胶。

04  质谱鉴定*范围 

辉骏生物可以检测各种类型的蛋白样本，例如蛋白溶液、干粉、胶条或斑点等，一次上机可以检测到高达1000多种蛋白质。以下列举了可能应用液质联用质谱（LC-MS/MS）的几个方向：（1）IP，Co-IP，pull-down类蛋白相互作用样本（胶条或溶液）的鉴定；（2）细胞器，外泌体等简单样本的蛋白质表达谱鉴定（全谱分析）。 

05  质谱鉴定*服务优势 

辉骏生物旨在为客户提供良好的质谱鉴定服务，可以进行几乎所有感兴趣的研究，如蛋白质组分析、小分子的高分辨率分析、复杂环境中小分子的定量分析等。

01 近十年服务经验，众多服务案例，服务成果得到优秀期刊认可； 02 自有互作实验平台，对IP、pull-down等微量蛋白的鉴定有十足把控力； 03 可以提供实验设计、样品制备、质量控制、质谱处理、生物信息学和统计分析等全套服务内容； 04 质谱仪器先进，操作人员技术成熟，鉴定准确度和灵敏度高； 05 售后技术支持将一直保持到客户发表文章，确保客户安心进行下游实验及投稿。