Q：收到细胞后，传代、冻存后复苏过几次都没什么问题，最近因实验室孵箱污染，清洁消毒细胞室后，重新复苏，结果连续复苏6支，细胞均未贴壁，今晚复苏6小时后观察有一瓶相对贴壁细胞数较之前复苏失败瓶多，但贴壁细胞状态不好，形态不佳，透光度亦不好！到底是哪里出了问题呢？

A：首先，复苏过程没有问题，是否是从液氮拿出直接放入温水，还有培养箱，二氧化碳浓度，培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%，看看能否帮助贴壁，当然也需要考虑血清问题，还有确信拿来的细胞没问题。

其次，应该怀疑冻存，实际上复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板，下面这些原因需要逐个排查：

1、冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，即使书上也不讲这个问题，但我因为这个问题就两种肺癌细胞和一种肝癌细胞专门做过试验，这个绝对是绝大部分人细胞复不活的一个原因。太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。
2、冻存液好不好，是什么，甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。
3、冻存液的量加的是不是太多，ATCC推荐是不超过7%，大于5%，太多也不好。
4、在冻存的时候是不是把DMSO混均匀，这个有一些影响，但不算太大。
5、冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格，很多人容易忘却这个事情，因为这个东西流程长。
6、如果细胞污染，是否能很快看到。从这个角度讲建议去除离心这步。
7、细胞在冻存前是否过密。
　　

还有，不赞成孵箱污染这个概念的，所有在一个孵箱里的细胞都污染一个细菌的话，这个细菌是源于孵箱的，但这不代表孵箱污染，因为孵箱无论你如何处理都有大量的细菌，问题在操作。细胞房不换拖鞋，非常脏，别人的细胞都污染，很多细胞都污染到绝种，但只污染一次（两年内只有两瓶），哪次是因为别人动了，每次细胞摆放顺序都是记住的。如果怀疑孵箱污染，那说明在养细胞这方面很差。

每次污染的原因都要尽可能的找，以后就不犯同样的问题，这个很重要，不能靠猜，否则就有可能细胞养绝最后换课题。