Co-IP 已经证明蛋白存在互作，下一步怎么找到具体的互作结构域和关键位点？

经典研究路线：Co-IP 验证互作→截短体定位互作区域→点突变锁定关键氨基酸→二次 Co-IP 验证→功能实验佐证。

辉骏生物结合 Nature Communications 文献案例，讲解截短体设计、点突变筛选与结果解读，带你准确找到蛋白互作结构域及关键位点。

为什么还要做截短体和点突变？

前期经 IP-MS、CoIP 或 GST pull-down 证实蛋白 A、B 存在互作，仅能确认二者能否结合。 若要解析互作机制，还需明确：蛋白 A 哪一区段参与互作，区段内哪个氨基酸起核心作用。

简单区分：截短体定位互作区段，点突变锁定关键氨基酸，下面介绍两种实验差异：

截短体如何确定互作结构域？

截短体实验就是把完整蛋白拆成不同片段，再分别检测哪些片段还能与另一个蛋白互作。

（1）截短体实验设计

可以参考UniProt、Pfam、InterPro、已有文献中的结构域信息进行设计；如果没有明确结构域，也可以先按较大范围分段，再逐步缩小。

例如蛋白A共有600aa，可以先构建全长和各截短体：

图1 蛋白A截短体示意图

（2）截短体结果解读

CoIP结果显示A-FL和A2可以拉下B，而A1、A3不能，说明A与B的互作区域初步定位在201–400aa。

图2 截短体Co-IP定位A与B互作结构域

如果还想进一步缩小范围，可以继续构建201-300aa、251-350aa、301-400aa等重叠截短体，再通过Co-IP继续定位。

文献中截短体Co-IP是怎么做的？

以PRMT1-FBXO7为例，作者构建PRMT1全长、23–162aa截短体和Δ23–162缺失体，并通过Co-IP检测与FBXO7的互作。

IP：FLAG → IB：GFP；结果表明缺失PRMT1 23-162氨基酸片段后条带消失，说明该片段是关键结构域。

图3 截短体Co-IP检测GFP-PRMT1和Flag-FBXO7互作

点突变怎么找关键氨基酸位点？

截短体缩小互作区域后，通常会结合已报道功能位点、翻译后修饰位点、保守性分析以及AlphaFold/分子对接结果，筛选几个候选氨基酸。

（1）点突变实验设计

例如预测A蛋白301–350aa中的K315、Y326、R342可能参与与B结合，就可以分别构建K315A、Y326A、R342A突变体，再通过Co-IP验证。

图4 蛋白A点突变示意图

（2）点突变结果解读

结果发现，WT、K315A和R342A仍能拉下B，而Y326A突变后B条带明显减弱甚至消失，说明Y326可能是维持A与B互作的重要氨基酸残基。

图5 点突变Co-IP检测A与B互作

注意：若单点突变仅轻微削弱互作、无法完全阻断，说明互作界面并非单残基主导，可开展双位点或多位点联合突变进一步验证。

文献中点突变Co-IP是怎么做的？

以PEAK3-Pan 14-3-3为例，作者构建多个PEAK3点突变体，并通过anti-FLAG Co-IP检测不同突变体与Pan 14-3-3的互作。

结果发现，当PEAK3的S69突变为A后，Pan 14-3-3的条带消失，说明S69是介导二者互作的关键氨基酸位点。

图6 点突变Co-IP检测PEAK3-FLAG与Pan 14-3-3互作

文献案例：从筛选互作一直做到关键位点

IP-MS 筛选得到转录因子 HOXA1 是 NONO 核心候选互作蛋白（图 7A）。 

Co-IP 正反拉验证 NONO 与 HOXA1 存在互作（图 7B）。 

GST pull-down 进一步佐证二者互作（图 7C）。 

构建 HOXA1 系列缺失突变体（图 7D）。 

截短体 Co-IP 结果显示，缺失 HD 结构域后互作信号减弱，证明 HD 为 HOXA1 与 NONO 互作核心结构域（图 7E）。 

AlphaFold2 建模预测 HOXA1 的 N230、I275、K286 及 NONO 的 E278、Q281、R287 为潜在互作位点（图 7F）。 

点突变 Co-IP 证实 HOXA1-K286A 突变会削弱结合，说明 K286 是二者互作关键氨基酸（图 7G）。

图7 截短体、点突变Co-IP验证HOXA1与NONO互作

有关 IP-MS、Co-IP、GST pull-down、截短体、点突变的实验技术问题，或是试剂相关需求，可咨询辉骏生物：4006991663。