肝脏是人体内最大的器官，在营养和能量代谢方面起着至关重要的作用。肝脏代谢紊乱将导致Ⅱ型糖尿病、血脂异常和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的产生。非酒精性脂肪肝炎（NASH）是NAFLD最极端的形式，也是肝硬化和肝细胞癌等终末期肝病的主要病因。

以往的研究发现肝内存在多种受体配体信号转导方式，且这种信号通讯在维持肝内组织稳态及肝损伤反应过程起到重要作用。尽管如此，单细胞水平下的细胞间通讯图谱及NASH发病过程中肝细胞的异质性特点仍未被阐明。

本研究通过单细胞转录组测序鉴定得到健康和NASH小鼠肝脏非实质细胞（NPC）细胞图谱，解析了在NASH过程中肝细胞间受体配体相互作用，并发现一种NASH相关的巨噬细胞，可能作为NASH治疗的良好靶标。

1. 肝脏NPC的单细胞图谱

为了探究NASH的发病机制，作者首先对健康和NASH小鼠的肝脏进行了常规转录组测序，与健康组相比，共筛选到772个差异基因，包括311个下调基因和461个上调基因（Fig. 1A-C）。对这些差异基因进行GO富集分析，发现下调基因主要富集在脂质代谢和氧化反应相关的GO条目；上调的基因则富集到细胞外基质、细胞粘附、吞噬和免疫反应等GO条目，而这些功能主要由肝脏中的非实质细胞（NPC）承担，表明在NASH发病机制中，NPC可能承担着较为重要的作用。因此作者从肝脏中分离了NPC进行单细胞转录组测序，以探究肝脏中NPC的异质性特点及其在NASH发病过程中的作用。

对健康和NASH小鼠肝脏NPC进行单细胞转录组测序分析，共获得33,168个细胞，鉴定到内皮细胞、巨噬细胞、T细胞等10种细胞类型(Fig1D-1F)，这些细胞类型在小鼠和人类之间表现出高度保守的转录特征(Fig. 1G)。将RNA-seq与scRNA-seq的结果联合分析，发现由NASH诱导上调的基因主要分布在巨噬细胞和肝星状细胞（HSC）中，NASH肝脏中下调的基因分布在肝实质细胞中(Fig. 1I)。

Fig. 1健康和NASH小鼠肝脏NPCs的scRNA-Seq分析

2. 单细胞水平的分泌因子与受体相互作用分析

单细胞转录组测序得到305个分泌因子与147个膜受体, 这些分泌因子与受体基因在不同的细胞类型中特异性表达，且表达模式在人和小鼠间高度保守（Fig.2A-C）。作者在此基础上构建了肝脏不同细胞间信号传递的高分辨图谱，其中HSCs、内皮细胞和巨噬细胞是旁分泌和自分泌信号的重要中心(Fig. 2D)。

Fig. 2 肝细胞分泌基因分析

3. 内皮细胞的血管信号传导功能

内皮细胞是NPC中最大的细胞群，共10,447个细胞，将内皮细胞进行二次聚类可得到4个亚群，分别为门静脉周围(Endo-pp)内皮细胞、中心周围(Endo-PC)内皮细胞，以及两个肝窦内皮细胞簇(LSEC-1和LSEC-2)，这些亚群独特的转录特征使它们能够在肝脏内不同的区域发挥不同的功能(Fig. 3A-C)。

为了探究NASH对内皮细胞功能的影响，作者结合scRNA-seq及内皮转录组测序结果，发现来源于NASH肝的内皮细胞表现出与脂质代谢、抗原呈递和趋化因子释放相关的基因表达量增加，而与血管发育和体内稳态有关的基因显著下调，对此作者通过流式细胞术和免疫荧光验证对上述结论进行了验证（Fig. 3E,F），并推测由于内皮细胞转录组的重编程导致了NASH期间窦状毛细血管的严重损伤。同时，在NASH样本中内皮细胞的膜受体及血管分泌因子（配体）的mRNA显著下调（Fig. 3H）表明在NASH期间血管和血管分泌素信号传导存在严重中断，并且这种中断也同时发生在人类NASH患者中(Fig. 3I)。

Fig. 3 内皮细胞亚群分析

4. NASH相关巨噬细胞的出现及其分子标记

通过分析健康和NASH来源的巨噬细胞数目，发现NASH组的巨噬细胞显著增多（Fig. 4A），对这些巨噬细胞进行亚型分析，可分为库普弗细胞（Kupffer cells，KCs）和单核细胞来源的巨噬细胞 (MDMs) (Fig. 4A.B)。为了探究NASH如何改变巨噬细胞的功能特性，作者开发了一种通过基因表达特征来定量评估巨噬细胞极化水平的算法，巨噬细胞极化指数(MPI)越高，炎症表型越显著，通过这一分析证实了NASH会诱导巨噬细胞向促炎表型转变（Fig. 4C），这与NASH疾病进程中的促炎环境相吻合。

接下来作者进一步分析了巨噬细胞的亚型特点，通过Trem2的表达可将KCs分为Trem2lo和Trem2hi两群（Fig. 4D），由于超过93%的Trem2hi来源于NASH，因此把这群细胞命名为NASH相关的巨噬细胞“NASH-associated macrophages”(NAMs)。另外，NAMs还高表达Gpnmb 和Cd9，这些基因可作为NASH的生物标记物。

Fig. 4 NASH相关巨噬细胞的鉴定

5. 肝星状细胞的受体配体信号网络

该研究另一项重要的发现是肝星状细胞活跃的信号传递功能。通过单细胞转录组测序共获得272个肝星状细胞（HSC），HSC的分泌组十分丰富，包含了多个编码膜蛋白和分泌因子的基因，作者选取了表达较活跃的分泌组基因构建了配体-受体信号网络，并将这一群独特的分泌因子命名为“Stellakines”，从网络图中可以看出这些Stellakines作用的主要细胞靶点是内皮细胞和免疫细胞（Fig. 5B）。同时，肝星状细胞表面还富集了多种受体，使其能够对不同的细胞外信号作出反应，起到肝内信号传递枢纽的作用(Fig. 5D)。

最后作者对肝星状细胞中的血管活性激素信号传导通路进行分析，并证实Stellakines的表达受到IL11自分泌信号的调控。虽然没有明确IL11的病理作用，但指出Stellakines的分泌失调是NASH进程中肝星状细胞的一个重要生物学特点。

Fig. 5 HSC信号转导网络

研究结论

本研究基于scRNA-seq测序，单细胞分辨率下绘制了主要的肝细胞群体中分泌配体和膜受体的转录图谱，并构建了配体-受体信号网络，为解构稳态和疾病中细胞间通讯的动态性质提供了蓝图。

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