当前位置:首页 > 新闻动态 > 公司新闻 > 「辉骏客户文章」Autophagy | 发现MIR516A在人类膀胱癌中的独特作用
公司新闻行业前沿促销优惠
「辉骏客户文章」Autophagy | 发现MIR516A在人类膀胱癌中的独特作用
发布时间:2021-04-28 15:47:29作者:辉骏生物-fitgene

LC-MS/MS蛋白鉴定实验客户高分文献-辉骏生物


背景:

根据以往报道,MIR516A在卵巢癌、肺癌、原发性胃癌和前列腺癌等多种癌症中下调,并起到肿瘤抑制作用。但MIR516A和PHLPP2在人类膀胱癌(BC)中的表达情况和潜在作用仍有待研究。


内容概述:

2021年4月,辉骏生物的合作伙伴,温州医科大学检验医学院黄海山教授团队在期刊Autophagy(IF2020=16.016)上发表题为“Oncogenic role of MIR516A in human bladder cancer was mediated by its attenuating PHLPP2 expression and BECN1-dependent autophagy“的文章。他们发现MIR516A在人类膀胱癌(BC)中的作用与在已往报道的抑癌作用相反,它并非作为BC抑制因子,而是一种促进因子。MIR516A在BC组织和细胞系中显著上调,抑制了其靶基因PHLPP2的表达,进而部分促进CUL4A介导的BECN1蛋白降解,减少了BC细胞自噬并促进BC生长。这是首次发现MIR516A在其他癌症中未被发现的独特功能。


主要技术:

RNA干扰(RNAi)、双荧光素酶实验免疫共沉淀(Co-IP)蛋白质谱检测(LC-MS/MS)、细胞自噬检测;

辉骏生物为本研究提供了蛋白质谱检测和分析服务


研究路线:

1
临床样本、体外细胞和体内异种移植瘤检测均表明MIR516A促进BC生长
2
工具预测、双荧光素酶WB等方法确认MIR516A靶向PHLPP2并下调其蛋白水平
3
RNAi和自噬检测等实验证明MIR516A-PHLPP2通过抑制BECN1减弱BC细胞自噬
4
Co-IP质谱等实验发现 MIR516A-PHLPP2促进cul4a介导的BECN1蛋白降解
5
体内实验表明MIR516A干扰上调PHLPP2和BECN1,同时下调MKI67



研究结果:

1. MIR516A促进体内和体外的BC细胞生长

qPCR检测了MIR516A在新鲜临床BC组织样本和人BC细胞系(TCCSUP、UMUC3、J82和RT112)中的表达,发现MIR516A在BC样本中的表达出乎意料的显著高于对照(图1A,B),这一结果与TCGA 数据库中19对膀胱癌组织的检测结果一致。


体外建立的MIR516A干扰(MIR516Ai)稳转株(BC细胞系:UMUC3和J82)和软琼脂实验结果也表明抑制MIR516A可以显著降低BC细胞的单层生长(图1C-E),也会损害其锚定依赖性生长(图1F,G)。这些结果表明,MIR516A不仅在人BC组织中过表达,而且起致癌作用。


在体内异种移植裸鼠模型中,注射MIR516A抑制剂减弱了裸鼠BC细胞的异种移植瘤生长(图1H,I),表明MIR516A促进体内膀胱肿瘤生长。


1661847758111198.jpg

图1


2. MIR516A靶向PHLPP2并下调其在人BC细胞中的蛋白水平

TargetScan工具预测了MIR516A的可能靶基因ACTG2、ETS2和PHLPP2(图2A),进而在MIR516Ai的BC细胞中后检测了三者的蛋白水平,发现PHLPP2上调(图2B)。已知PHLPP2是一种良好的肿瘤抑制因子,因此选定其为研究目标。PHLPP2在BC细胞中的过表达显著抑制了细胞的锚定非依赖性生长(图2C,D);双荧光素酶实验进一步确定了MIR516A对PHLPP2 mRNA 3’UTR的调控(图2E,F);qPCR实验表明MIR516A不影响PHLPP2 mRNA水平(图2G)(图2G),预测MIR516A可能通过抑制其蛋白翻译而下调PHLPP2。


那么, MIR516A是否通过PHLPP2影响BC细胞的锚定依赖性生长?在MIR516Ai细胞中继续敲低PHLPP2,这增加了细胞的锚定非依赖性生长(图2H,I),表明MIR516A诱导的PHLPP2下调在MIR516A促进BC细胞生长中起作用。

1661847712890757.jpg

2


3. 抑制MIR516A可诱导BC细胞自噬并抑制锚定非依赖性生长

为了研究MIR516A对BC的调节机制,研究者在体外BC细胞(UMUC3和J82)中干扰MIR516A(MIR516Ai),自噬标记物LC3从LC3-I到LC3-II的转变(图3A)、LC3点状聚集物(图3B-D)和自溶酶体的形成(图3E,F)表明MIR516A诱导了BC细胞自噬;而当MIR516Ai细胞继续敲除PHLPP2后,这些自噬现象都受到抑制(图3G-J)。


抑制MIR516A可诱导自噬,所以是自噬导致BC细胞生长抑制的吗?研究者采用自噬抑制剂BAF处理MIR516Ai细胞,这导致LC3-II水平的显著累积(图3K),并逆转了MIR516Ai对细胞锚定非依赖性生长的抑制(图3L,M),表明MIR516A抑制人BC细胞中的自噬,进而促进BC细胞生长。

1661847697825005.jpg

图3

 

4. MIR516A高表达通过抑制BECN1减弱BC细胞自噬

MIR516A是否对自噬相关蛋白质(ATGs)的表达有影响呢?对MIR516Ai细胞中这些蛋白的检测发现,只有BECN1(启动自噬的关键蛋白)上调了(图4A,B,再继续敲低PHLPP2后,BECN1表达均减弱了(图4C),表明BECN1被MIR516A抑制,并可能在MIR516A引起的自噬抑制通路中起作用。接着,他们在同时干扰MIR516A和PHLPP2的BC细胞中过表达BECN1,发现LC3-II转化显著增加(图4D),细胞锚定非依赖性生长显著被抑制(图4E,F)。敲低MIR516Ai细胞中的内源性BECN1(图4G)降低了LC3-II转化、点状聚集物形成和自溶酶体形成(图4H-J),也挽救了MIR516Ai细胞的锚定非依赖性生长(图4K,L)。


这些结果表明,抑制MIR516A导致BECN1上调,进而诱导BC细胞自噬,且抑制其锚定非依赖性生长。

1661847681124921.jpg

图4

 

5. MIR516A-PHLPP2通路促进了cul4a介导的BECN1蛋白降解

在同时干扰MIR516A和PHLPP2的BC细胞中检测BECN1 mRNA和蛋白水平,发现其mRNA没有变化(图5A),但是蛋白降解速率增加(图5B-D)。此外,MIR516Ai显著降低了BECN1蛋白的降解速率。之后,作者采用免疫共沉淀(Co-IP)质谱鉴定(LC-MS/MS)方法筛选了BECN1的互作蛋白,发现BECN1的互作蛋白中没有PHLPP2,但却包括E3泛素蛋白连接酶的几个核心成分CUL3、CUL4A和CUL4B,并显示出更高的肽谱匹配数(图5E)。据报道,CUL3和CUL4可以通过泛素化介导的蛋白酶体调节BECN1蛋白的稳定性和降解。因此作者检测了MIR516A和PHLPP2对这些蛋白表达的影响,发现只有CUL4A蛋白水平有变化(图5F)。Co-IP实验证实CUL4A和BECN1具有相互作用(图5G)。CUL4A过表达和干扰实验显示,CUL4A促进BECN1蛋白降解。这些结果表明,MIR516A-PHLPP2依赖CUL4A促进BECN1蛋白降解。

1661847424437331.jpg

图5


6. 体内实验表明MIR516Ai上调PHLPP2BECN1,同时下调MKI67

体内异种移植瘤免疫组化(IHC)实验显示,MIR516Ai导致PHLPP2与BECN1表达上调、MKI67(癌细胞增殖标志物)阳性BC细胞持续减少(图6A-D),并且PHLPP2表达与BECN1表达呈正相关(r=0.8235,p=0.0013)(图6E)。


总之,这些结果表明,MIR516A抑制通过结合PHLPP2 mRNA的3′UTR上调PHLPP2,导致CUL4A介导的BECN1蛋白降解减少,并进一步增加BECN1介导的自噬,从而抑制BC生长(图6F)。

 

1661847410256942.jpg

图6

电子邮箱

service@fitgene.com

联系电话

020-32053431 / 400-699-1663

联系地址

广州市黄埔区科学城广州国际企业孵化器D506

微信咨询

微信扫码一对一咨询

服务热线
4006991663
在线客服 返回顶部