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用于基因同种型分析的全长转录组测序
发布时间:2021-12-10 09:39:25作者:辉骏生物-fitgene

转录组测序 对研究人员很重要,因为它们帮助我们了解细胞机器如何解释基因组序列以及这些序列的改变。 它们对于许多功能分析也是必要的。 如果没有适当的转录组注释,就不可能进行 RNA-seq 研究来探索差异基因表达或预测组织或生物体中存在哪些蛋白质。


现在测序技术已经发展到可以很快以比以前更低的成本为更广泛的生物(包括单细胞真核生物)生成高质量的基因组参考和转录组注释的地步。虽然基因组将很快组装成具有合理可靠性的染色体规模支架,但技术限制阻止转录组注释技术识别从这些染色体表达的基因和同种型。


现在可以使用短读长测序、链接短读长测序、长读长测序和光学作图等技术的组合来构建高质量的“着丝粒到端粒”基因组序列。基因组组装现在正进入黄金时代。从单细胞真核生物到北极熊的非模式生物将从这些强大且相对便宜的方法中受益匪浅,而这些方法以前缺乏以艰难的方式生成高质量基因组参考所需的注意力和大笔资金——染色体图谱、桑格测序细菌人工染色体文库等。


大多数基因组组装突破不适用于转录组注释。短读长和长读长测序技术现在用于转录组注释,但是,它们都存在缺陷,使得实现“参考级”转录组注释既耗时又困难。



异构体的全长转录组测序工作流程

300 ng 总 RNA 用于异构体测序。选择 poly-A RNA 后,将其转化为 cDNA,为文库组装做准备。此外,最多可对 12 个样品进行多重分析,以实现一种简化且经济高效的方法。

获得测序数据后,选择两侧有 cDNA 引物和 poly-A 尾的读数作为全长读数。然后可以按转录本异构体对读数进行分组,以产生独特的共识。



然后可以将异构体映射到参考基因组,并且可以使用 SQANTI 和 Maker 等工具以基于参考的方式注释异构体。PacBio 的 Iso-Seq 分析采用一键式生物信息学程序来处理同种型数据,而无需参考基因组或从头方法注释。



全长转录本测序的应用

基因组注释是的首次应用全长转录序列。这在植物和动物科学中特别有用,其中基因组通常比人类基因组复杂得多,并且参考质量的基因组组装可能仍然非常昂贵。


全长转录本还有助于表征以前由于片段重复而难以识别的人类基因。研究人员观察了在大脑中表达的具有长片段重复的 19 个基因家族,发现由于新的转录起始、剪接和聚腺苷酸化位点,近一半的表达基因重复与其祖先模型发生了显着变化。


其他人已经采用全长 RNA 测序以类似的方式分析可变剪接和多聚腺苷酸化谱,但这次是在物种之间。

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