DNA
复制反应是细胞增殖的核心,与癌症、衰老和发育障碍等人类疾病的病因学密切相关。 复制叉是正在进行的 DNA
合成的场所,它既是一个拥挤又充满活力的地方,在正常复制条件下或特别是在复制应激线索之后,各种蛋白质在全球或特定基因组区域不断或短暂地结合在一起。
除了众所周知的复制体成分外,最近还发现了各种以其在 DNA 修复或其他细胞过程中的功能而闻名的因素与复制叉有关。
这些相互作用的动态可以提供有关在特定环境中复制叉或复制位点附近发生的问题或反应类型的有价值的信息。
因此,能够提供有关复制过程和相关蛋白质的敏感和定量信息的工具对于我们对复制相关 DNA 代谢的理解至关重要。
追求这一追求,出现了允许全基因组监测复制过程的革命性方法。
特别值得一提的是分子梳理,这是一种单分子分辨率分析,涉及基因组梳理和复制叉速度和源间距离的监测。染色质免疫沉淀(IP;ChIP)-on-chip/ChIP 测序(ChIP-seq)结合芯片上的 BrdU-IP,测量蛋白质-DNA 相互作用水平与正在进行的区域的技术通过使用细胞群实验以全基因组方式掺入胸苷类似物 BrdU 揭示了复制。
这些技术继续证明对于理解复制过程和受蛋白质与染色质动态结合影响的其他染色体结构过程非常有用。 但是,由于它们很费力,因此不适合大屏幕。
与
ChIP-on-chip/ChIP-seq 方法相关,但专注于发现与新生 DNA 相关的蛋白质,而不是在染色质上精确定位它们的位置,是使用在新生
DNA 上分离蛋白质 (iPOND),这是一项突破性的技术,其中与新复制的 DNA 交联的蛋白质被分离和解析。
在 iPOND 中,新复制的 DNA 用胸苷类似物 EdU 标记,并使用点击化学与生物素结合。
在染色质剪切和基因组纯化后,通过蛋白质印迹分析或通过使用质谱法在细胞培养中用氨基酸 (SILAC) 进行稳定同位素标记来解析与生物素化 DNA
交联的蛋白质。 ChIP-on-chip 和 iPOND 都非常有价值,但它们很费力,需要大量的起始材料,并且定量潜力有限。 更进化的 ChIP-seq 和 iPOND-SILAC 技术是定量的,但它们需要高成本和专用设备。 在这个问题上, 实验人员描述了一种灵敏而准确的单细胞分辨率技术,可以轻松识别与新复制 DNA 结合的蛋白质。
这项新技术被称为 DNA 复制叉处蛋白质相互作用的原位分析 (SIRF),是 iPOND 和邻近连接分析 (PLA) 的改进版本,用于检测和测量原位蛋白质 - 蛋白质相互作用。 在 SIRF 中,就像在 iPOND 中一样,新合成的 DNA 用 EdU 标记,然后通过 EdU 和生物素-叠氮化物之间的点击化学进行生物素化。 在 SIRF 中,细胞随后与针对生物素和目标蛋白质的一抗一起孵育( 图 1 ),然后该协议遵循改进的、高度灵敏和准确的 PLA 检测的原则。 也就是说,将细胞与偶联有作为邻近探针的寡核苷酸的二抗一起孵育。 如果二抗接近 <40 nm,表明检测的蛋白质和生物素化 DNA 之间存在直接相互作用,则 DNA 寡聚体能够退火,引导形成有切口的环状 DNA 分子。 连接后,DNA 环作为模板用于局部滚环扩增。 然后将 DNA 序列特异性荧光 DNA 探针与扩增的 DNA 环退火,从而使信号可视化和量化( 图1 )。
图一:SIRF 工作流程
(A) 新生 DNA 用 EdU 标记。 (B) 新生 DNA 使用点击化学进行生物素化。 (C) 使用针对因子 X 和生物素化 DNA 的一抗进行原位杂交。 一抗被与序列特异性 DNA 寡聚体偶联的二抗识别。 如果因子 X 和新生 DNA 接近,寡聚物会退火并形成环状 DNA 分子,然后将其连接起来。 (D) 滚动循环复制为每个表位与表位的相互作用产生了大约 100 个环状 DNA 分子。 环状 DNA 分子随后被荧光探针识别,从而为产生的相互作用信号提供放大和特异性。
在他们的研究中,实验人员提供了 SIRF 中灵敏度、接近度和定量的验证数据。 作者通过几个已知或预期与复制叉相关的蛋白质示例顺利地引导 SIRF 读者,例如增殖细胞核抗原 (PCNA) 和复制蛋白 A (RPA),为 SIRF 的灵敏度比正常值高得多提供证据免疫荧光以及如何可靠地量化所研究的蛋白质与新生 DNA 的相互作用。实验人员验证了先前使用 iPOND 技术获得的发现,例如将 MRE11 核酸酶募集到叉的要求。 他们还对 53BP1 丢失对复制叉关键蛋白质相互作用的影响带来了新的见解。 敏感的 SIRF 方法在所有测试场景中都发挥了作用,有望在未来几年内对复制叉进行研究。
由于几个原因,SIRF
方法值得注意。 首先,SIRF 几乎不需要起始材料(每个条件约 10,000 个细胞),但其高灵敏度允许检测在不受干扰的条件下 IF
无法观察到的因素,例如 RPA 和 RAD52。 其次,通过改变实验条件,当 EdU
被少量胸苷赶走时,可以研究停滞或折叠叉处相同蛋白质的数量,或复制叉后面的募集。 最后,SIRF 可以与异质细胞群中的其他 IF
参数结合使用,例如细胞周期标记、早期或晚期复制细胞的染色以及特定受体的存在。
这种单细胞分辨率功能,在测量细胞群平均值的方法中不存在,使人们能够了解蛋白质与复制叉的相互作用如何受到影响或与细胞群环境中的其他参数相关联。
新 SIRF 技术为回答几个重要问题开辟了道路。 例如,复制体和 DNA 代谢因子(如 RPA、RAD51、RAD52 和
MRE11)在未受挑战的复制和停滞的分叉期间无法通过常规 IF 检测到,但它们可以通过 SIRF
轻松检测到,支持其他依赖卤化的敏感技术的结果特定蛋白质的 DNA pulldown 和蛋白质印迹分析和 iPOND 结果。 鉴于 SIRF 的准确性和高灵敏度,用一组能够结合暴露在新复制 DNA 尖端的单链 DNA (ssDNA) 的蛋白质来解决复制叉相互作用中的面板变化,并将这些变化与据报道,在相同的实验条件和细胞系中,在叉处发生 DNA 转变。
由于提议用于介导特定 DNA 转换的用于检测翻译后修饰的蛋白质的抗体可能可用,当与其他方法结合使用时,SIRF
可以提供有关蛋白质修饰动态、与新生 DNA 的相互作用以及复制叉处的 DNA 转换的有用信息.
此外,由于它能够检测不属于复制体通常成分但后来在复制叉后部关联的因子——可能在暴露于新生 DNA 附近的 ssDNA 区域或新生 DNA
本身——SIRF 具有潜力为了帮助揭示可能促进复制后修复的因素,这个话题仍然鲜为人知,尤其是在哺乳动物细胞中。 当与提供染色质状态以及某些基因组区域(如着丝粒或端粒)信息的表观遗传标记和特定结合物的 IF 相结合时,SIRF 有望为 DNA 复制如何在全球或特定基因组区域和不同区域的调控提供答案。
总之,SIRF 技术为理解局部蛋白质-复制叉相互作用如何导致复制叉结构和染色体结构的动态变化开辟了新途径。 这些问题对于理解与染色体复制相关的基本 DNA 代谢过程和监测临床环境中复制叉的关键相互作用非常重要。
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