中文标题：磷脂过氧化驱动的软骨生成转录因子修饰介导了烷氧基诱导的胚胎骨发育损伤

发表期刊：Redox Biology

中科院分区：1区

影响因子：10.787

发表时间：2022年8月

合作单位：暨南大学

运用技术：iTRAQ蛋白质组学分析（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

产前母亲压力与分娩不良有关，比如早产、婴儿死亡率高或出生体重低等。母体压力引起的胚胎骨发育不良是一种典型的发育障碍，被认为是氧化应激损伤导致的，但其具体机制尚不明确。子宫发生内源性氧化还原反应或受到外源刺激都会形成各种自由基（如烷氧基自由基）并传递给胚胎，使胚胎受到氧化损伤。2,2′-偶氮双[2-甲基丙脒]二盐化物(AAPH)是一种经典的烷氧基自由基生成物，被广泛应用于氧化应激相关的研究，本项目利用AAPH深入探讨了烷氧基自由基诱导鸡胚胎骨发育缺陷的确切机制。

● 研究结果

1. 烷氧基自由基会延缓胚胎骨骼发育

首先，研究人员通过注射AAPH建立鸡胚胎慢性氧化应激模型：在胚胎发育第1.5天开始注射，之后每隔一天注射一次，共注射5次（图1A）。胚胎发育第17天时，AAPH处理的胚胎死亡率显著升高（图1B）、胚胎重量减少（图1C）、肢体生长迟缓（图1D）。为了确定在软骨内骨形成过程中是否已经发生肢体畸形，对胚胎发育第7天的胚胎软骨进行染色，结果与第17天一致，都呈现较短的肢体（图1E）。软骨内骨化是胎儿早期肢体发育的关键步骤，可分为停滞区、增殖区（PZ）、肥大区和钙化区（图1F）。对胫骨生长板的石蜡切片进行H&E染色（图1G），发现AAPH处理导致PZ的结构被破坏、长度缩短（图1H）。这些结果表明烷氧基自由基诱导的氧化应激导致了软骨发育异常，从而阻碍了胚胎骨生长。

  图1

2. 铁下垂与烷氧基自由基诱导的软骨发育缺陷有关

为了确定氧化应激诱导异常软骨发生的分子机制，研究人员对AAPH处理和对照的鸡胚软骨组织进行了iTRAQ标记蛋白质组学分析（图2A），共鉴定出1534种可信蛋白质（置信度≥95%），其中16种蛋白质上调，2种蛋白质下调（图2B）。此外，富集分析显示，差异表达蛋白富集在铁离子结合途径中（图2C）；KEGG分析表明，差异蛋白富集在铁下垂途径、花生四烯酸代谢、肌动蛋白细胞骨架调控途径等（图2D和E）。之后，western blot实验验证了与铁下垂相关的关键差异蛋白（图2F），其中DMT1和TFR1蛋白在AAPH组表达升高，GPX4和SLC7A11蛋白在AAPH组表达降低（图2G）。此外，AAPH处理还可促进MDA产生和GSH消耗（图2H和I），并显著降低骨组织中GPX和SOD的活性（图2J和K）。用铁下垂诱导剂RSL3处理鸡胚，当剂量在1.0至10.0 nM之间时，胚胎死亡率显著增加（图2L），胚胎重量显著降低（图2M）。阿尔西安蓝染色表明RSL3处理显著抑制了胚胎肢体的生长（图2N）。这些结果说明，铁下垂在氧化应激诱导的骨发育障碍中起重要作用。

图2

3. 铁下垂抑制剂减轻了烷氧基自由基诱导的软骨发育缺陷

为了证实铁下垂在异常骨发育中的作用，在体内使用了Fer-1和DFO。Fer-1减轻了胚胎发育第17天AAPH处理组的鸡胚死亡率上升（图4A）和重量下降（图4B）；Fer-1也能减弱AAPH对胫骨生长的抑制（图4C和D）。H&E染色显示，Fer-1处理恢复了发育的骨骼中胫骨PZ的收缩（图4E和F）。DFO处理的鸡胚也观察到类似趋势。与发育第17天一样，AAPH处理也加重了发育第7天的胚胎死亡率和重量下降（图4G和H）。DFO显著缓解了AAPH引起的胫骨缩短（图4I和J）。

图3

4. 烷氧基自由基会引发软骨细胞铁过载

铁是芬顿反应传播磷脂过氧化所必需的。DMT1和TFR1是两种主要的铁转运蛋白，有助于细胞中的铁代谢。对DMT1和TFR1表达水平的ITAQ检测（图2A）和WB检测（图2G）说明铁参与了烷氧基自由基阻碍软骨形成的过程。接下来，研究人员检测了软骨细胞中铁的变化。AAPH/RSL3处理的细胞中Fe2+水平较高，Fer-1和DFO处理会降低Fe2+水平（图5A-C）。为了进一步了解铁在软骨形成中的作用，用siRNA干扰铁下垂相关蛋白DMT1的表达（图5D），这逆转了AAPH对成骨相关基因BMP6、COL2A1和ACAN的抑制作用（图5E）。以上体外研究结果说明，铁过载在氧化应激干扰胚胎成骨过程中起关键作用。

图4

5. 富含烷氧基自由基的软骨细胞中，氧化磷脂（OxPL）的积累抑制软骨生成

磷脂双烯丙基位置的PUFA氧化是过氧化和铁下垂的驱动因素，研究人员利用C11-BODIPY染色测量了脂质过氧化水平（图6A），结果显示AAPH或Erastin处理导致了细胞中脂质过氧化产物的积累，而Fer-1处理抑制了脂质过氧化。通过氧化还原脂质组学分析确定了五大类氧化磷脂（OxPL）：磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰基丝氨酸（PS）、磷脂基甘油（PG）和磷脂酰肌醇（PI）（图6B）。与对照组相比，AAPH组表现出明显的脂质过氧化模式（图6C），单氧化和二氧化磷脂种类大量增加（图6D和E）。1-硬脂酰-2-花生四烯酰磷脂酰乙醇胺（SAPE-OOH）能否直接促进骨骼发育呢？用外源性SAPE-OOH处理ATDC5细胞后，Bmp6、Co12a1和Acan等骨发育有关基因的表达被抑制（图6F）。这些结果说明富含烷氧基自由基的软骨细胞中的OxPL积累，抑制了软骨形成过程。

图5

图6

6. 4-HNE修饰驱动了SOX9蛋白的泛素依赖性降解

转录因子SOX9是软骨发生的关键调节因子。结果显示，AAPH处理降低了SOX9蛋白水平而非mRNA水平（图7A和B），也严重干扰了软骨发生相关基因的表达，DFO处理能逆转这些变化（图7C）。4-HNE是脂质过氧化的最终产物，能够与多种蛋白质反应形成HNE蛋白质加合物，改变其活性或诱导其降解。研究者发现4-HNE结合蛋白水平在AAPH处理后显著增加（图7D）。那么SOX9蛋白的下调是否与4-HNE修饰相关？Co-IP结果表明，AAPH处理导致与4-HNE结合的SOX9增多（图7E）。免疫荧光染色进一步证实了4-HNE和SOX9的共定位（图7F）。正如预期，DMT1干扰削弱了SOX9与4-HNE的结合（图7G）。CHX实验表明，外源4-HNE处理显著促进了SOX9蛋白的降解（图7H），但蛋白酶体抑制剂MG132抑制了AAPH导致的SOX9蛋白水平下降，自噬抑制剂3-MA几乎没有作用（图7I）。用泛素和SOX9质粒共转染SW1353细胞，AAPH处理促进了SOX9的K48泛素化，DMT1-siRNA逆转了这一结果（图7J和K）。这些发现表明，在软骨细胞中，脂质过氧化最终产物4-HNE通过蛋白质修饰来调节SOX9的泛素-蛋白酶体降解。

图7

●   总结

本研究证明了烷氧基自由基诱导产前骨生长迟缓和软骨细胞凋亡的相关信号通路：烷氧基自由基通过胚胎中铁介导的芬顿反应导致软骨细胞中氧化磷脂的显著积累，此外脂质过氧化终产物4-HNE的作用，它与关键的软骨形成转录因子SOX9形成加合物，导致其降解，从而抑制软骨形成。

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