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He S.W. et al: AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma

中文标题:AR诱导的长非编码RNA LINC01503促进鼻咽癌SFPQ-FOSL1轴的增殖和转移

发表期刊:Oncogene

中科院分区:1区

影响因子:8.756

发表时间:2020年1月

合作单位:中山大学肿瘤防治中心

运用技术:RNA pull-down MS结合蛋白鉴定(由辉骏生物提供技术支持,点击查看服务详情)


● 研究背景

鼻咽癌(NPC)是一种起源于鼻咽腔粘膜的上皮性恶性肿瘤,局部复发和远处转移是鼻咽癌死亡的两个主要原因。因此,识别鼻咽癌复发转移的关键生物标志物及其机制,对鼻咽癌患者个体化治疗的发展具有重要意义。

 

本研究发现LINC01503在NPC中高表达并与不良预后有关,在体外促进NPC细胞的增殖,迁移和侵袭,在体内促进肿瘤的生长和转移。LINC01503募集了SFPQ来激活FOSL1转录。雄激素受体(AR)激活了NPC细胞中LINC01503的转录,导致AR配体依赖性的细胞生长、迁移和侵袭。


这些发现表明,AR诱导的LINC01503可以通过SFPQ-FOSL1通路促进NPC发展,或成为新的NPC预后标志物和治疗靶标。




● 研究结果

1. LINC01503在鼻咽癌中高表达,与预后不良相关

在先前的全基因组lncRNA图谱中发现,LINC01503在鼻咽癌组织中高表达(图1A)。为了证实这一结果,研究者用定量RT-PCR方法检测了20例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽组织中LINC01503的表达水平。结果表明,LINC01503在鼻咽癌组织中明显过表达(图1B);此外,与正常鼻咽上皮细胞NP69和N2Tert相比,LINC01503在11个鼻咽癌细胞系中表达显著上调(图1C)。后续临床分析结果表明,LINC01503水平高的患者总体、无病和无远处转移的生存率比LINC01503水平低的患者差(图1D-F)。研究者结合LINC01503的表达和TNM分期数据,构建了一个预测鼻咽癌(214例)预后的模型,将鼻咽癌患者分为三组,Kaplan-Meier曲线显示这三组鼻咽癌患者的生存前景不同(图1G-I)。综上所述,这些发现表明LINC01503在鼻咽癌中高表达,可作为判断鼻咽癌预后的生物标志物。

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  图1


2. LINC01503促进鼻咽癌细胞体外生长、迁移和侵袭                         

为了确定LINC01503在鼻咽癌中的潜在作用,研究者在HK1细胞中特异性地下调了内源性LINC01503的表达,然后进行RNA-seq以确定LINC01503被敲除后所影响的下游基因。针对这些基因的生物信息学分析结果表明,LINC01503与鼻咽癌的进展密切相关(图2A)。为了验证这些发现,研究者使用两种不同的shLINC01503质粒瞬时下调了LINC01503在HK1和SUNE1细胞中的表达,并进行了体外功能分析(图2B)。结果进一步表明,LINC01503基因的敲除显著抑制了鼻咽癌细胞的生长、增殖迁移与侵袭能力(图2C-F)。

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图2


3. LINC01503与SFPQ直接结合

已有报道表明,LncRNA通过与特定蛋白相互作用而发挥功能。研究者使用生物素标记的LINC01503正义或反义序列进行RNApull down实验,然后进行质谱分析鉴定与LINC01503相互作用的蛋白(图3B)。结果表明,剪接因子SFPQ是高度富集的蛋白之一(图3C)。为进一步验证LINC01503与SFPQ之间的相互作用,研究者用抗SFPQ抗体进行了RIP实验,发现LINC01503 RNA明显富集(图3D),敲除LINC01503后LINC01503与SFPQ之间的相互作用消失(图3E)。接下来,为确定LINC01503与SFPQ结合所需的特异性片段,研究者构建了一系列LINC01503截短质粒并进行了RNA pull down实验,发现LINC01503的敲除或过表达既不影响SFPQ mRNA水平,也不影响SFPQ蛋白水平(图3H,I)。这些结果表明,LINC01503可以直接与SFPQ结合。

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图3

 

4. LINC01503招募SFPQ激活FOSL1转录

作为一种多功能核蛋白,SFPQ可以作为转录抑制因子或激活因子来调节基因表达。为了确定LINC01503/SFPQ在鼻咽癌中的靶基因,研究者分析了LINC01503基因敲除前后HK1细胞的RNA-seq数据。在前20个上调和下调的基因中,FOSL1在鼻咽癌组织中过表达,且与LINC01503的表达呈正相关(图4B,C)。LINC01503或SFPQ的敲除都能降低FOSL1mRNA和蛋白水平(图4D,E)。接下来,Transfac和Weblogo程序预测到在FOSL1基因的启动子区域有两个SFPQ结合位点(图4F,G)。ChIP-PCR结果表明,LINC01503基因敲除后,FOSL1启动子区域的SFPQ富集现象可被显著消除(图4H)。此外,荧光素酶报告分析表明,过表达SFPQ显著提高了FOSL1野生型启动子结构的荧光素酶活性,但不能增加突变报告结构的荧光素酶活性(图4I)。最后,DNase I酶切分析表明,LINC01503或SFPQ基因敲除显著抑制了FOSL1启动子位点的染色质可及性(图4J)。这些结果表明,LINC01503可以招募SFPQ激活FOSL1转录活性并增加其表达。

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图4

 

5. FOSL1负责LINC01503/SFPQ介导的鼻咽癌进展

为了确定LINC01503/SFPQ是否通过激活FOSL1促进鼻咽癌的进展,研究者在HK1和SUNE1细胞中引入FOSL1过表达或空载体,稳定下调LINC01503(Sh1503)或其对照(ShCtrl),CCK-8和集落形成实验表明,过表达FOSL1可以解除LINC01503基因敲除对细胞生长和增殖的抑制作用(图5A-C)。Transwell分析表明,LINC01503的过表达逆转了LINC010503基因敲除对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(图5D)。这些结果表明,LINC01503通过激活FOSL1促进鼻咽癌的进展。

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图5


6. LINC01503敲除对鼻咽癌肿瘤生长和转移的抑制作用

为确定LINC01503在鼻咽癌生长和转移中的作用,研究者建立了肿瘤生长模型。结果表明,LINC01503基因的敲除显著延缓了肿瘤的生长,并在大小上明显小于对照组(图6A-C)。接下来,研究者建立了腹股沟淋巴结转移模型(图6D),结果显示LINC01503基因敲除组腹股沟淋巴结较小,重量较轻(图6E,F);肿瘤侵袭性较弱,对皮肤和肌肉的侵袭能力减弱(图6G);腹股沟淋巴结转移率明显低于对照组(图6H,I)。还建立了肺转移定植模型,结果表明LINC01503基因敲除组肺表面转移结节较对照组少(图6J,K),转移结节较对照组明显减少和缩小(图6L)。这些数据均表明,LINC01503在体内促进了鼻咽癌肿瘤的生长和肺转移。

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图6


7. AR激活LINC01503转录以增加其在鼻咽癌中的表达

 使用Jaspar软件对LINC01503的启动子进行分析,预测了两个转录因子:ALX Homeobox 3(ALX3)和AR(图7A)。研究者发现AR的敲除明显降低了LINC01503在HK1和SUNE1细胞中的表达,ALX3的敲除则没有(图7B)。此外,AR的过表达增加了LINC01503的RNA表达(图7C)。更重要的是,AR在鼻咽癌中表达上调,并与LINC01503的表达呈正相关(图7D,E)。研究者用Jaspar软件预测了LINC01503启动子区域的两个高亲和力结合位点(图7F),CHIP-PCR显示AR的异位表达显著增强了其在LINC01503启动子区域的富集(图7G)。荧光素酶报告实验结果表明,AR的敲除显著降低了野生型LINC01503启动子结构的荧光素酶活性,但没有降低突变报告结构的荧光素酶活性(图7H)。最后,通过DNase I酶切实验,研究者观察到AR基因敲除显著抑制了LINC01503启动子位点的染色质可及性(图7I)。这些结果说明AR激活了鼻咽癌LINC01503的转录。

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图7


8. AR拮抗剂ENZ可能通过阻断LINC01503的上游转录来抑制鼻咽癌的恶性进展

 为了进一步阐明LINC01503的AR配体依赖性激活,研究者进行了AR反应和抑制试验。结果表明,在AR激动剂双氢睾酮(DHT)处理过程中,LINC01503呈时间依赖和剂量依赖的激活;在拮抗剂苯扎鲁胺(ENZ)存在下,LINC01503呈时间依赖和剂量依赖的抑制(图8A,B)。有趣的是,DHT处理导致细胞功能的激活,而AR处理则导致细胞功能的抑制(图8C-E),接下来,研究者研究了LINC01503的表达对ENZ抑制的鼻咽癌细胞恶性表型的影响,发现ENZ抑制的细胞生长、迁移和侵袭可以通过增加LINC01503在细胞中的表达来逆转(图8F-H)。这些结果证实了AR拮抗剂ENZ可能通过阻断LINC01503的上游转录来抑制鼻咽癌的恶性进展。

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图8


辉骏生物实验外包服务商,10年专注科研实验,专业提供全方位蛋白质组学蛋白/核酸互作代谢组学分子/细胞生物学lncRNA专题实验等科研服务。辉骏自有蛋白质检测平台,RNA pulldown产物等微量蛋白的质谱鉴定有充足的把控能力对后续的生物信息分析有独到的见解。


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