Q：IP、Co-IP、Pull-down的应用是什么？

Co-IP：体内条件下，研究蛋白间的相互作用；

Pull-down：体外条件下，研究蛋白间的相互作用；大多是用来鉴定或者是识别相互作用比较强的蛋白质。

IP是利用特异性抗体将样品中的靶蛋白沉淀（收集）下来；

Co-IP在IP实验中维持目标蛋白与互作蛋白的结合状态，实现二者共同沉淀收集；依目标蛋白不同分两类：内源蛋白Co-IP，通常需IP级别抗体；外源蛋白Co-IP（标签蛋白Co-IP），适用于IP级别抗体不佳或内源蛋白表达量低的情况，需构建带标签的目的质粒并转染至细胞。

Pull-down是将带GST、His等标签的目标蛋白结合于树脂/磁珠，通过蛋白标签-配体亲和作用纯化目标蛋白，再与样本裂解液孵育，捕获其中的互作蛋白。

IP/Co-IP多用组织细胞材料，靶蛋白为内源天然/过表达蛋白（可融合标签）；Pull-down诱饵蛋白多为重组表达。IP/Co-IP需高亲和力一抗，选购关注验证数据。简言之，IP捕获目的蛋白，Co-IP捕获目的蛋白及互作蛋白，Pull-down以带标签重组蛋白捕获互作蛋白。

IP实验流程：提取组织/细胞裂解液，与诱饵蛋白抗体、Protein A/G Beads依次共孵育，经漂洗液清洗去除未结合蛋白，加洗脱液洗脱诱饵蛋白，最终通过WB或质谱检测洗脱液中蛋白。

内源蛋白Co-IP流程：提取组织/细胞裂解液，与诱饵蛋白抗体、Protein A/G Beads依次共孵育，经漂洗液多次清洗去除未结合蛋白，加洗脱液洗脱诱饵-互作蛋白复合体，最终通过WB或质谱检测洗脱液中的蛋白。

标签蛋白Co-IP流程：取含诱饵蛋白与互作蛋白的裂解液，与标签抗体磁珠孵育结合，经漂洗液清洗去未结合蛋白，加洗脱液洗脱诱饵-互作蛋白复合体，洗脱液蛋白用WB或质谱检测。

做IP实验常遇抗体磁珠孵育洗脱后，WB出现抗体轻重链杂带的痛点，杂带易掩盖目的互作蛋白条带，导致结果难解读、实验失败。推荐科研神器——标签纳米抗体磁珠，羊驼来源的纳米抗体为单链结构，分子量约15kD，无传统抗体重轻链，从根源解决轻重链污染问题，且成本低、亲和力佳，助力获得优质IP实验结果！

图7 纳米抗体磁珠无抗体轻重链的IP结果示意图

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Pull-down实验流程：体外表达带标签诱饵蛋白，与亲和介质孵育纯化后，和样本裂解液共孵育，经漂洗液清洗去未结合蛋白，加洗脱液洗脱诱饵-互作蛋白，洗脱液蛋白用WB或质谱检测。

文献实例：CoIP和Pulldown验证2个蛋白的互作，并确定结合位点

免疫共沉淀结果显示，人源高分化肝癌细胞系中PRMT1与FBXO7存在相互作用，该发现揭示了潜在的全新细胞信号传导途径，为研究细胞内互作关系提供重要线索。

图9 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

293T细胞中转染Flag-AATF全长及截短体质粒，发现其全长与XRCC4互作；构建截短体验证结合结构域，证实缺失331-380氨基酸片段后XRCC4条带消失，确定该区域为二者互作靶点。此结构域的明确，为解析AATF与XRCC4互作分子机制提供核心依据，助力探究二者协同参与的细胞生理/病理进程，为后续机制研究和靶向策略开发奠定重要基础。

图10 引自Elevated nonhomologous end-joining by AATF enables efficient DNA damage repair and therapeutic resistance in glioblastoma. Nat Commun 16(1):4941(2025). 

pull down 实验结果表明，在293T细胞中观察到了GSNOR与NEDD4之间的直接相互作用。 这一实验证据证实了两种蛋白的体外结合关系，为后续解析其在细胞内的功能关联与调控机制提供了关键支撑。

图11 引自[辉骏客户文章] NEDD4-Mediated GSNOR Degradation Aggravates Cardiac Hypertrophy and Dysfunction. Circ Res 136(4):422-438(2025). 

GST下拉实验证实，大肠杆菌纯化的重组GST-USP5与PD-1存在相互作用。研究者构建USP5不同结构域缺失截短体探究互作关键区域，结果显示，相较USP5-WT或ΔZnF-UBP，同时缺失UBA1和UBA2的USP5 ΔUBA1/2突变体完全丧失与PD-1的互作能力，证实USP5通过UBA1、UBA2结构域与PD-1结合。该结构域的鉴定，为解析二者互作分子机制提供核心依据，也为后续探究其参与的细胞生理/病理进程、开发靶向调控策略奠定重要基础。

图12 引自ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitinationto modulate tumor immunotherapy. Nat Commun 14(1):2859(2023).

辉骏生物Co-IP、GST pull-down客户文章

客户结果呈现：IP-WB结果表明，使用辉骏生物的磁珠在样品中获得了单一清晰的靶蛋白条带，且富集效率高，具备卓越的特异性 （Flag-GPX4与HA-OTUB1免疫共沉淀结果）

客户结果呈现：使用辉骏生物的GST pull-down试剂盒下拉分析，表明GST-DSS1与LC3B的存在直接的相互作用。

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