IP-MS做完，一次鉴定出几百个蛋白，到底应该先验证谁？

蛋白评分越高越可靠吗？为什么有些高丰度蛋白，反而可能是背景污染？

IP-MS真正难的不是鉴定出多少蛋白，而是从中筛出值得进一步验证的候选互作蛋白。

辉骏生物从候选蛋白筛选、实验质控到Nature Communications文献案例，讲清楚IP-MS数据怎么看、候选蛋白怎么筛以及后续如何验证。

IP-MS到底在筛什么？

IP-MS主要通过免疫沉淀（IP）富集目标蛋白（Bait）及其相关蛋白复合物，再利用LC-MS/MS鉴定其中的蛋白。

图1 IP-MS鉴定STAMBPL1互作蛋白

注意：IP-MS不是鉴定到的蛋白越多越好，关键是Bait组相较对照组是否特异富集。

几百个蛋白里，候选互作蛋白怎么筛？

拿到质谱结果后，可以按照下面3步筛选：

第一步：比较Bait-IP组与IgG对照组

将Bait-IP组的鉴定蛋白扣除IgG对照组中检出的共有蛋白，剩下的实验组独有蛋白可作为候选互作蛋白。

但候选互作蛋白仍有很多，因此还需要结合蛋白鉴定列表、生信分析进一步筛选。

第二步：看蛋白鉴定列表

重点关注蛋白评分（Score）、肽段数及覆盖度，辅助判断蛋白鉴定的可靠性。

注意：

①评分高代表蛋白的可信度更高，但是评分高低不是寻找关键互作蛋白的唯一标准。

②高分不一定是真互作。比如某些高丰度蛋白（如角蛋白、细胞骨架蛋白）或常见结合蛋白，需慎重选择。

③低分也不一定是假阳性。有些真实互作蛋白含量较低，或与诱饵蛋白结合较弱，检测到的肽段较少，评分就可能偏低。因此还需要结合生信分析蛋白功能综合判断。

• IP-MS需要做三次重复吗？

IP-MS初步筛选是属于定性实验，没有重复影响不大，后续通过CoIP-WB或pull-down WB验证到真实互作即可。不过IP-MS有一定假阳性率，也可以做重复，筛选重复鉴定到的蛋白，可有效提升候选互作蛋白的可靠性。

图2 IP-MS筛选重复鉴定到的蛋白

第三步：结合生信分析

通过UniProt查询候选蛋白的功能及亚细胞定位，结合GO、KEGG分析相关生物学过程和信号通路，并利用STRING、BioGRID查询已知蛋白关联及互作信息。

再结合课题研究方向、分子对接分析，综合鉴定质量+生信分析+文献依据，筛出关键候选蛋白。

进一步通过Co-IP、GST pull-down等实验验证。

图3 关键互作蛋白筛选方法

IP-MS实验质控怎么做？

在送质谱前，需要重点关注Input-WB和IP-WB。

1、Input-WB：样本里有没有？

先检测Input中是否存在Bait。如果Bait本身表达量过低，后续IP可能难以获得足够的蛋白互作复合物。

图4 Input-WB检测诱饵蛋白表达

2、IP-WB：到底拉没拉下来？

检测IP产物中Bait的富集情况，确认免疫沉淀是否成功。如果Bait本身富集不足，建议先优化IP条件，再考虑送质谱。

图5 IP-WB检测IP是否成功

Nature Communications案例解析

这篇Nature Communications提供了非常完整的蛋白互作研究思路，从筛选互作一直做到关键位点。

蛋白质组学与IP-MS联合筛选：发现HMGCS1是MAT2A候选互作蛋白（图6A）。

Co-IP：证实MAT2A与HMGCS1存在互作（图6C）。

GST pull-down：进一步证明二者直接结合（图6D）。

截短体Co-IP：发现MAT2A的DM区域（121–250aa）和HMGCS1的N端区域（1–186aa）参与二者结合（图6E–G）。

分子对接：预测关键氨基酸位点，构建点突变体（图6H-I）。

点突变Co-IP：位点突变后，二者相互作用明显减弱，进一步验证关键结合位点（图6J）。

图6 MAT2A-HMGCS1蛋白互作机制研究

辉骏生物IP-MS蛋白互作组学解决方案

IP-MS能否筛到高质量候选互作蛋白，很大程度取决于前期IP富集、样本质控及后续质谱数据分析。

辉骏生物可提供：IP富集 → Input/IP-WB质控 → LC-MS/MS鉴定 → 生信分析 → Co-IP/GST pull-down验证

一站式完成从“候选互作蛋白筛选”到“互作验证”。

IP-MS筛选互作蛋白，关键不是“鉴定到多少蛋白”，而是综合判断蛋白评分、鉴定质量、重复性及蛋白功能相关性。

如果你的研究目标是寻找目标蛋白的未知互作蛋白，可参考这条路线：

图7 IP-MS鉴定技术路线图

学会筛选 IP-MS 互作候选蛋白，才能避免白做后续验证实验！ 

有蛋白质谱、修饰质谱、Co-IP、GST pull-down 实验外包、互作试剂盒采购需求的老师同学，欢迎咨询辉骏生物，专业团队助力蛋白互作研究。