当诱饵蛋白IP抗体不好用或者内源表达量低时，可以在样本中融合表达带有特定标签的诱饵蛋白（Bait），利用标签抗体做免疫沉淀。

样本裂解后，与偶联了标签抗体的beads孵育，将“诱饵蛋白-互作蛋白”一起“共沉淀”到抗体Beads上。洗掉未结合的蛋白后，再将“诱饵蛋白-互作蛋白”从Beads上洗脱下来，得到Co-IP洗脱液，该洗脱液既可用于Western  Blot检测（验证已知结合蛋白），也可用于质谱鉴定（筛选未知结合蛋白）。

图1 标签蛋白Co-IP实验原理图

实验大致步骤（以在HEK293T细胞调取Flag-Bait蛋白为例）：细胞铺板→质粒转染→总蛋白提取→Input样品制备→总蛋白与Flag磁珠孵育→蛋白洗脱→WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白。

1 细胞铺板

（1）转染前HEK293T细胞计数后以1.5×10⁶/皿铺至6 cm皿中，十字法铺匀细胞；

（2）置于细胞培养箱中培养，待细胞密度达到70%-80%且状态良好时即可用于转染。

2 质粒转染 

（1）取两个1.5 mL EP管各加入200 µL Opti-MEM培养基，A管加入6 μg质粒，B管按质粒：PEI=1：3的比例加入18 µL PEI；

（2）混匀、瞬时离心后室温静置5 min，后将两个EP管中液体混为一管，室温静置20 min；

（3）用200 µL加样枪将EP管中的液体均匀滴加入HEK293T细胞的培养基中，并放入细胞培养箱中。

3 总蛋白提取

（1）转染48 h后用IP裂解液（辉骏货号为：FI8101）提蛋白。

（2）用预冷PBS缓冲液清洗细胞2-3次，加入300-500 μL预冷的IP裂解液，在IP裂解液中预先加入3-5 μL蛋白酶抑制剂（辉骏货号为：FI8105），现用现配；

（3）4℃混匀仪上裂解30 min；

（4）为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清（如果无超声条件，可置于冰上裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5 s）；

（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

4 Input样品制备

（1）所提蛋白每组各取30 μL，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液充分混匀；

（2）95℃加热5-10 min，通过Western Blot实验对质粒在HEK293T细胞中的表达情况进行验证。

5 总蛋白与Flag磁珠孵育

（1）磁珠预处理：每组取10-20 μL Anti-Flag纳米抗体磁珠（辉骏货号为：FI8201），加入200 μL漂洗缓冲液（辉骏货号为：FI8107），颠倒混匀30次；

（2）放磁力架上静置1 min，弃上清；

（3）重复上述洗涤步骤1次；

（4）向磁珠中加入相应组别的样本裂解液，充分混悬，置于4℃混匀仪上孵育2 h或4℃孵育过夜；

（5）放磁力架上静置1 min，弃上清，加入500 μL漂洗缓冲液，颠倒混匀30次；

（6）放磁力架上静置1 min ，弃上清，重复上述洗涤步骤2次。

图2 标签蛋白Co-IP实验分组流程图

（2）放磁力架静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，进行SDS-PAGE或Western Blot检测，如果需要进行质谱检测，则切胶条后送检。

6.2 非变性洗脱 

（1）向磁珠中加入40-50 µL洗脱缓冲液（辉骏货号为：FI8102），涡旋振荡20 s，放混匀仪上室温洗脱10-15 min，涡旋振荡20 s；

（2）1000 g离心20 s，放磁力架上静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脱后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和质谱等实验。

7 WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白

7.1 WB检测是否存在靶蛋白

通过蛋白印迹(Western Blot)技术分别使用Anti-Flag和Anti-Prey对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够检测在沉淀中同时存在诱饵蛋白和猎物蛋白，则说明这两种蛋白之间存在相互作用。

7.2 质谱鉴定洗脱液中的蛋白

通过质谱（LC-MS/MS）技术对IP洗脱液中的蛋白成分进行鉴定和分析，筛选诱饵蛋白的未知互作蛋白。

PS：辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析。

1.保证加入蛋白酶抑制剂，实验需在冰上操作，避免蛋白出现降解；

2.使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和PH值合适；

3.清洗次数会影响最终结果，清洗次数过多会导致弱结合蛋白被洗脱，检测信号弱；清洗次数过低会导致非特异性结合未被清洗干净，信噪比高；

4.IP实验应设置阴性对照组，通常采用表达Flag标签空载体的样本作为对照；

5.商业化的Flag磁珠将Flag抗体共价偶联在磁珠上，当采用非变性洗脱法时不易产生抗体污染，但如果用热变性洗脱，还是会检出部分抗体，出现“抗体轻重链污染”问题。

PS:辉骏生物标签纳米抗体磁珠结合量高，亲和力强，无轻重链污染。