GST pull-down 实验出现条带，就一定代表两种蛋白发生直接互作吗？条带颜色越深，是否意味着蛋白互作亲和力更强？

GST pull-down 是体外研究蛋白相互作用的经典实验技术，既能验证已知蛋白的结合关系，搭配 WB 完成目标蛋白检测，也可联合质谱筛选潜在未知互作蛋白。不少科研人员在实验过程中经常碰到各类难题：无目的条带、杂带背景高、实验重复性差，同时还有一个高频疑问：为什么 GST pull-down 能够跑出阳性结果，体内 Co-IP 实验却无法复现？

辉骏生物系统讲解 GST pull-down 实验原理、标准操作步骤、科学的结果判读方法，结合 WB 验证与质谱筛选相关文献案例，全方位解答体外蛋白互作实验中的各类常见困惑，助力科研人员避开实验误区，规范论文结论撰写。

GST pull-down实验原理

GST pull-down主要利用GST与谷胱甘肽（GSH）之间的高亲和力来进行蛋白富集。

简单来说，就是先将GST融合蛋白作为“诱饵蛋白”固定到谷胱甘肽树脂上，再加入待检测的蛋白样本进行孵育。如果样本中存在能够与诱饵蛋白结合的蛋白，就会一起被“拉下来”。

孵育结束后，通过洗涤去除未结合或非特异结合的蛋白，再将结合在树脂上的蛋白复合物洗脱下来，得到最终的GST pull-down产物。

得到的产物可以通过：

Western Blot（WB）：检测已知互作蛋白；

质谱（MS）：筛选和鉴定未知互作蛋白。

图1 GST pull-down原理图

GST pull-down实验详细步骤

1、实验前准备

正式实验前，需要提前准备好：

图2 GST pull-down实验前准备

注意：诱饵蛋白的表达量、纯度和状态非常重要。蛋白纯化不好、出现降解或大量聚集，都可能影响后面的pull-down结果。

2、实验详细步骤

注意：孵育时间、蛋白用量和洗涤条件是比较关键的几个环节。

洗涤太弱，容易出现杂带和非特异结合；洗涤太强，又可能把真正的弱互作蛋白一起洗掉。

因此，需要根据具体蛋白的性质对实验条件进行调整。

GST pull-down结果怎么看？

做完实验后，重点看两个部分：Input和pull-down。

① Input

利用Anti-GST、Anti-His等抗体对实验前的蛋白样本进行WB检测。

主要看：

GST-X诱饵蛋白有没有正常表达；

His-Y待测蛋白有没有正常表达；

蛋白大小是否正确；

所用抗体能不能正常检测到目标蛋白。

Input正常，是后面分析pull-down结果的基础。

② pull-down

首先利用Anti-GST检测pull-down产物中的GST-X诱饵蛋白，确认诱饵蛋白是否被正常富集。

再利用Anti-His检测pull-down产物中有没有His-Y待测蛋白。

如果GST-X组能够拉下His-Y，而GST空载对照没有明显His-Y条带，说明GST-X与His-Y之间存在特异性相互作用。

图3 GST pull-down实验结果解析图

注意：如果使用的是两个纯化后的重组蛋白进行pull-down，在排除其他蛋白参与的情况下，可以进一步支持二者存在直接结合。

• 条带越深，说明蛋白互作越强吗？

不能直接这么判断。

pull-down条带深浅除了受到蛋白互作影响，还会受到Input蛋白量、诱饵蛋白上样量、树脂结合效率、孵育时间、洗涤条件、抗体以及曝光时间等多种因素影响。

所以，普通GST pull-down更多用于判断“有没有互作”，不能单纯根据一张WB图的条带深浅，就判断两个蛋白的结合亲和力大小。

GST pull-down文献案例解读

1、GST pull-down验证LC3与TRIM25互作

IP-MS实验筛选鉴定与LC3相互作用的蛋白为TRIM25、RNF213（图4a）。

转录组和免疫组化实验发现TRIM25在疾病样本中显著上调，而RNF213无明显变化，因此选定TRIM25作为后续验证靶标（图4b，c）。

Co-IP正反拉实验证实LC3与TRIM25存在相互作用（图4d）。

GST pull-down实验进一步证实LC3和TRIM25蛋白之间存在直接相互作用（图4e，由辉骏生物提供GST pull-down试剂盒）。

图4 引自[辉骏生物客户文章] GST pull-down验证LC3与TRIM25互作

我们从d图中可以看到很明显看到抗体轻重链条带的干扰。那么对于这种情况，我们能帮您解决麻烦：

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图5 辉骏生物HA纳米抗体磁珠无抗体轻重链的IP结果示意图

2、GST pull-down MS筛选GST-RdRp潜在互作蛋白

诱饵蛋白nsP4(RdRp)的结构域截短示意图（图6A）。

GST pull-down实验结合SDS-PAGE电泳及抗GST抗体Western blot检测，完成GST-RdRp下拉蛋白的初步验证与分析（图6B、6C）。

GST-RdRp下拉的蛋白经SDS-PAGE电泳后，切取凝胶蛋白样本进行质谱鉴定分析（图6D）。

GST pull-down MS与Co-IP MS实验联合分析、KEGG及GO功能富集分析显示，筛选出RACK1为关键候选互作蛋白（图6E、6F）。

图6 GST pull-down MS筛选GST-RdRp潜在互作蛋白

辉骏生物自有质谱检测平台，拥有15年蛋白质谱鉴定经验，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析。

GST pull-down 看似操作简单，实则成败全藏在细节里。诱饵蛋白制备、蛋白纯化、孵育条件、洗涤严谨度，直至后续 WB 或质谱检测，任一环节把控不到位，都容易出现无目的条带、杂带严重、实验难以重复等问题。

另外两个关键结论一定要记牢：

1. GST pull-down 检出条带，不能单纯依靠条带深浅判定互作亲和力强弱；

2. 当 GST pull-down 和 Co-IP 结果相悖时，也不要直接判定某一组实验失效，需要结合实验体系差异，搭配多重验证实验综合解读。

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