做完IP-MS，一次鉴定出几百个蛋白，经过筛选终于找到了几个感兴趣的候选互作蛋白。

那么问题来了：这些蛋白真的和目标蛋白存在互作吗？Co-IP有条带就能证明吗？如果还想知道两个蛋白具体是哪个区域结合，又该怎么做？

常见的研究思路是：IP-MS筛选 → Co-IP验证 → GST pull-down验证直接结合 → 截短体定位互作区域 → 点突变验证关键位点。

辉骏生物结合Nature Communications文献，带大家看看这些实验具体怎么设计，结果又该怎么看。

IP-MS筛选：找到候选互作蛋白

如果已知目标蛋白（Bait），但不知道它的互作蛋白，可以通过IP-MS筛选。

图1 内源IP-MS筛选SFRP1的互作蛋白

• 内源IP-MS与外源IP-MS有什么区别？

内源IP-MS是直接利用目标蛋白抗体进行IP，但常规抗体轻重链可能干扰WB检测或质谱鉴定。

外源IP-MS则过表达带有Flag、HA等标签的诱饵蛋白，利用标签纳米抗体磁珠来进行IP实验，能彻底避免轻重链污染，无论是WB还是质谱实验都是适用的。

图2 外源IP-MS筛选Flag-TPL2的互作蛋白

IP-MS鉴定到的蛋白不一定都是真正的互作蛋白，还需要实验进一步验证。

辉骏生物IP专用二抗、Flag/HA/V5/GFP/RFP 这5款类型的标签纳米抗体磁珠，有效避免抗体轻重链污染，结合量高，亲和力强。

Co-IP：体内验证蛋白互作

筛选出候选蛋白后，通常先做Co-IP，验证两个蛋白在细胞内是否存在相互作用。

以FGL1和TRIM21为例，用FGL1抗体进行IP，再通过WB检测TRIM21，同时设置IgG对照组。

图3 Co-IP实验分组设计

如果IP实验组能够检测到TRIM21，且IgG组没有明显特异信号，说明二者存在互作。

图4 Co-IP验证FGL1与TRIM21蛋白互作

GST pull-down：进一步验证能否直接结合

GST pull-down使用体外表达纯化的重组蛋白，可用于研究两个蛋白是否直接结合。

以GST-X和His-Y为例，将GST-X固定在谷胱甘肽磁珠上，再加入His-Y孵育，同时设置GST空载对照组。洗涤后，通过WB检测是否富集到His-Y。

图5 GST pull-down实验分组设计

如果GST-X组能够检测到HIS-Y蛋白，而GST空载组没有明显富集，说明GST-X与HIS-Y蛋白存在互作。

图6 GST pull-down验证GST-X与HIS-Y蛋白互作

截短体Co-IP：定位互作结构域

如果已经验证两个蛋白存在互作，还可以继续研究它们到底是哪个区域在结合？

可以参考UniProt、Pfam、InterPro及文献中的结构域信息设计截短体；如果没有明确线索，可先将蛋白分成较大的片段，再逐步缩小范围。

例如，将A蛋白分成A1、A2、A3几个片段，分别与B蛋白进行Co-IP。

图7 A蛋白截短体实验设计

CoIP结果显示A-FL和A2可以拉下B，而A1、A3不能，说明A与B的互作区域初步定位在201–400aa。

图8 截短体Co-IP定位A与B互作结构域

如果还想进一步缩小范围，可以继续构建201-300aa、251-350aa、301-400aa等重叠截短体，再通过Co-IP继续定位。

找到互作区域后，还可以结合分子对接和点突变实验，进一步研究哪些氨基酸参与结合。

Nature Communications案例：从IP-MS做到关键位点

实际研究中，这些实验又是怎么串起来的？以一篇Nature Communications文献为例。

IP-MS：筛选鉴定出Asprosin的候选互作蛋白为PFKP（图9A）。

正反拉Co-IP：证实Asprosin与 PFKP存在互作（图9B、C）。

His pull-down： 进一步证明二者能够直接结合（图9D）。

截短体Co-IP：实验表明PFKP的D1结构域是与Asprosin的互作区域（图9E、F）。

突变体Co-IP：Asprosin突变后，与PFKP结合能力显著丧失（图9G）。

研究思路： IP-MS 筛选 → Co-IP 验证 → His pull-down进一步验证 → 截短体互作区域定位 → 分子对接与突变验证。

图9 IP-MS筛选GCLM互作蛋白

辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析，实验咨询：4006991663。

简单来说：IP-MS找候选，Co-IP验证互作，GST pull-down验证直接结合，截短体Co-IP定位关键区域。

大家在做蛋白互作实验时，最容易卡在哪一步？是Co-IP没有条带、GST pull-down结果不理想，还是截短体不知道怎么设计？以上困惑欢迎随时联系辉骏生物，技术专员跟您快速解答，得出有效实验方法！

联系技术支持

18927549347、13430303037