研究蛋白质相对定量的蛋白质组学方法

差异蛋白表达的测量为检测细胞的整体变化提供了一种直接而准确的方法。定量蛋白质组学对于发现诊断或预后蛋白标志物、检测新的治疗靶点以及了解基本的生物学过程和机制具有重要意义。随着质谱技术的发展，我们可以利用更可靠和动态的方法来分析蛋白质的差异表达。

定量蛋白质组学可分为相对定量和绝对定量。相对定量是研究不同情况下蛋白质组表达的差异，主要方法有稳定同位素标记和无标记定量。绝对定量是获得蛋白质的特定表达水平。以下是相对定量蛋白质组学常用的一些技术。

代谢标记需要在富含培养基的稳定同位素中培养样品。 SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）依赖于将特定“轻”或“重”形式的氨基酸代谢结合到蛋白质中。经过多次细胞分裂后，蛋白质被稳定同位素标记。来自“轻”和“重”培养物的蛋白质可以通过质谱一起分析。由于质量差异，质谱中根据这两种肽的面积进行相对定量。目前常用的有亮氨酸、精氨酸、赖氨酸等氨基酸。

图 1. SILAC 的工作流程

除了定量蛋白质的研究外，SILAC技术还用于翻译后修饰蛋白质的鉴定和修饰，以及蛋白质的相互作用。该技术在处理前引入标签，因此误差小，重现性好。然而，SILAC只适用于细胞样本，而且由于培养细胞需要很长时间。

2. 化学标签——iTRAQ

引入同位素在体外，适用于细胞、体液、组织等样品。有几种代表性方法，例如用于相对和绝对定量的等压标签 (iTRAQ) 标记肽 N 端氨基，酯化标记标记肽 C 端羧基 (-COOH)，ICAT 用于半胱氨酸硫醇 (-SH) 和很快。以下重点介绍 iTRAQ。 iTRAQ实验非常适合比较不同处理中的样品、生物复制并提供相对定量。

图 2. iTRAQ 的工作流程

iTRAQ标记定量蛋白质组学由Applied Biosystems Incorporation 开发，是一种利用多重等压化学标记试剂的技术。该试剂由报告基团、平衡基团和肽反应基团组成。肽反应基团将 iTRAQ Reagent 同量异位标签与肽的每个赖氨酸侧链和 N 末端基团共价连接，标记给定样品消化物中的所有肽。在 MS/MS 图中，不同样品标记中的相同蛋白质表现出相同的质荷比。通过比较 MS/MS 报告离子的峰面积和所得峰比来实现定量。

3. 无标签

无标记定量技术可以确定两个或多个样品中蛋白质的相对量。无标记定量不会将稳定同位素引入蛋白质，这与其他蛋白质定量方法不同。

无标记定量技术通常有两种方式。定量值可以通过提取母离子色谱峰的面积——曲线下面积 (AUC) 或 MS1 信号强度方法来测量。第二个是基于分配给给定蛋白质的光谱数，称为光谱计数。在光谱计数方法中，来自同一蛋白质的已识别 MS/MS 光谱的数量与蛋白质丰度直接相关。一般来说，样品中蛋白质的丰度越高，通过切割产生的肽就越多。并且消化产生的肽越多，质谱鉴定出的唯一匹配肽就越多，对应的光谱数量也就越多。

蛋白质组学是对细胞或组织表达的所有蛋白质的系统分析，质谱是必不可少的分析工具。质谱法可用于检测细胞或组织中对外部或内部干扰作出反应的蛋白质组的变化，称为定量蛋白质组学。

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