Wang W.J. et al： Endonuclease G promotes autophagy by suppressing mTOR signaling and activating the DNA damage response

中文标题：内切酶G通过抑制mTOR信号传导和激活DNA损伤反应来促进自噬

发表期刊：Nature Communications

中科院分区：1区

影响因子：17.694

发表时间：2021年8月

合作单位：暨南大学

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

研究概述：

内切酶G (ENDOG)是一种线粒体核酸酶，已知参与许多细胞过程，但其在自噬中的作用尚不清楚。本研究发现线粒体释放的ENDOG促进饥饿期间的自噬。通过对人类细胞系、小鼠、果蝇和秀丽隐杆线虫的实验发现，这种自噬在物种间是进化保守的。在饥饿状态下，糖原合成酶激酶3-β介导的ENDOG在Thr-128和Ser-288位点的磷酸化增强了其与14-3-3γ的相互作用，导致14-3-3γ释放Tuberin (TSC2)和磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基3 (Vps34)，随后mTOR途径被抑制并开始自噬。或者，ENDOG通过其内切酶活性激活DNA损伤反应并引发自噬。

研究结果：

1、ENDOG促进肝细胞中的自噬流

先前的研究证明ENDOG同源物CPS-6在秀丽隐杆线虫受精时能调控自噬作用，那么ENDOG是否也能调控一般自噬呢？在人肝细胞系（L02和HepG2）中过表达ENDOG显著增加了LC3B-II积累，降低了自噬底物SQSTM1表达，促进了自噬体形成（图1a-d），而干扰ENDOG显著抑制了许多核心ATG蛋白的表达和磷酸化。mCherry-GFP-LC3双荧光指示实验表明ENDOG过表达能增强肝细胞中的自噬流。ENDOG敲除细胞系在正常和应激条件下(饥饿、雷帕霉素和CQ处理)的自溶体形成被显著抑制（图1e-m），表明ENDOG促进自噬流。

图1

2、ENDOG缺失抑制了多种物种中饥饿诱导的自噬

接着，研究者进一步探索了ENDOG在体内能否促进自噬以及该功能在不同物种间是否保守。与对照组相比，ENDOG敲除小鼠在饥饿处理后，其肝脏中的LC3B积累减少，SQSTM1表达增加，自噬小泡数量减少（图2a-d）。饥饿处理后，ENDOG敲低果蝇的脂肪体细胞中mCherry-Atg8a（LC3同源物）的积累比未敲低组少（图2e）。在正常和饥饿条件下，秀丽隐杆线虫中ENDOG同源物cps-6的缺失均显著降低了GFP的水平（图2f）；在侧线细胞和咽肌中，cps-6的缺失抑制了GFP::LGG-1（LC3同源物）点的数量（图2g-h）。这些结果表明，在小鼠、果蝇和秀丽隐杆线虫中，ENDOG促进自噬这一功能是保守的。

图2

3、ENDOG通过抑制mTOR信号通路促进部分自噬

为了探索ENDOG诱导自噬的机制，研究者检测了mTOR信号通路（自噬负调节因子）的参与情况。在人正常肝细胞L02及其他肝癌细胞系中，ENDOG的缺失都增加了mTOR及其底物的磷酸化水平（图3a，b）。ENDOG敲除小鼠肝脏中的mTOR及其底物的磷酸化显著增加（图3c，d）。当使用RHEBQ64L来持续激活mTOR，发现其部分恢复了mTOR活性（图3e、f），降低了ENDOG过表达细胞中LC3B-II的积累和自噬体的形成（图3e–h）。但在ENDOG过表达的细胞中，LC3B-II的积累和自噬体的数量仍然多于RHEBQ64L过表达的野生型细胞。这些数据表明，ENDOG可部分通过抑制mTOR信号来促进自噬。

4、ENDOG通过与14-3-3γ相互作用抑制mTOR通路

随后，研究人员进行了ENDOG的免疫共沉淀和质谱（IP-MS）法来进一步探索ENDOG通过mTOR促进自噬的机制。他们在质谱结果中发现可以调控mTOR活性的14-3-3γ。Co-IP WB实验证实了14-3-3γ与ENDOG的相互作用。免疫荧光染色表明14-3-3γ与ENDOG共定位。

ENDOG是否影响14-3-3γ与其他自噬相关蛋白的相互作用呢？CoIP实验发现，ENDOG的过表达抑制了TSC2/Vps34和14-3-3γ之间的相互作用（图3i）。IP WB实验还表明，饥饿处理略微增强了ENDOG和14-3-3γ之间的内源性相互作用，而削弱了TSC2/Vps34与14-3-3γ的相互作用（图3j）。过表达14-3-3γ能重新激活mTOR途径，减少LC3B-II的积累和SQSTM1的降解，并减少ENDOG过表达细胞中自噬体的形成（图3k–m）。这些结果表明，ENDOG与14-3-3γ竞争性结合，使14-3-3γ释放TSC2（mTOR的负调节因子）和Vps34，抑制mTOR通路并启动自噬。

图3

5、GSK-3β介导的ENDOG磷酸化增强了其与14-3-3γ的相互作用

已知14-3-3蛋白主要通过与靶蛋白的一般共有序列RXXpS/TXP结合而起磷酸化作用，预测发现ENDOG的T128和S288磷酸化可能分别与14-3-3γ的S59和E18形成氢键。因此，将ENDOG的T128和S288进行突变，T128/S288变为A128/A288、T128/S288变为D128/D288，以模拟非活性（AA）和活性形式（DD）。Co IP结果表明AA形式抑制了ENDOG和14-3-3γ之间的相互作用，DD形式增强了这种相互作用（图4a，b）。而单独的突变对它们的相互作用没有影响。与野生型ENDOG和ENDOG-DD相比，ENDOG-AA在BafA1处理下的自噬体数量和LC3B-II积累较少（图4c、d），且不能再抑制mTOR通路来促进LC3B-II积累和SQSTM1降解（图4e，f）。此外，ENDOG在T128和S288的双重磷酸化对于其与14-3-3γ的相互作用和自噬的诱导是必要的。

预测发现激酶AKT和GSK-3β可能磷酸化ENDOG的T128和S288。然而实验表明，AKT过表达显著降低了ENDOG磷酸化，GSK-3β过表达显著增加了ENDOG磷酸化（图4g，h），增强了ENDOG和14-3-3γ之间的相互作用（图4g，h），但引入ENDOG的非活性形式（AA）后，这种作用被消除（图4i，j）。体外磷酸化实验也证实了GSK-3β磷酸化ENDOG（图4k）。

图4

6、ENDOG通过激活DNA损伤反应促进自噬

RHEBQ64L处理后ENDOG诱导的自噬仅部分恢复，推断ENDOG促进的自噬中可能存在额外的途径。DNA损伤反应是饥饿过程中的早期事件，由PARP-1/AMPK或ATM/CHK2途径介导，在自噬中起着重要作用。实验表明，ENDOG的缺失显著抑制了饥饿诱导的DNA损伤（图5a-e）。ENDOG敲除抑制了正常条件下PARP-1的表达和激活，阻断了饥饿诱导的AMPK激活和mTOR抑制（图5f，g），抑制了CHK1和CHK2的激活，从而抑制自噬（图5h，i）。结果表明ENDOG诱导的DNA损伤可能促进饥饿过程中的自噬。

图5

那么阻断DNA损伤反应是否可以抑制ENDOG诱导的自噬呢？实验表明， ENDOG增强了依托泊苷诱导的DNA损伤（图6a-c）。同时，ENDOG敲除显著抑制了DNA损伤反应（增加了p-H2A.X和p-ATM表达）（图6d，e）。此外，依托泊苷处理的ENDOG敲除细胞的p-H2A.X显著减少，并且在恢复期p-H2A.X的减少更快（图6f，g）。这些数据表明ENDOG增强了DNA损伤反应。使用ATM特异性抑制剂KU-60019阻断DNA损伤反应后，ENDOG诱导的DNA损伤、LC3BII积累、p-H2A.X水平和自噬体的数量显著降低（图6h-k）。但在KU60019的处理下，ENDOG过表达细胞仍然具有更多的p-H2A.X。这些数据表明，ENDOG还可以通过激活DNA损伤反应来诱导自噬。

图6

6、ENDOG的核酸内切酶活性对自噬诱导至关重要

之后，研究者构建了各种突变体来确定ENDOG的哪个结构域对DNA损伤和自噬诱导至关重要（图7a），将这些突变体过表达到ENDOG敲除细胞中，并用依托泊苷处理。与野生型、Del 1-48（删除线粒体靶向序列）和ENDOG NLS（用核定位序列取代线粒体靶向序列）相比，EM ENDOG（突变氨基酸以消除其内切酶活性)过表达细胞中的p-mTOR、p-ULK1、p-p70S6K和SQSTM1表达更高，表明EM ENDOG失去了抑制mTOR活性和自噬促进的能力（图7b，c）。除了EM形式，野生型和这些突变体在ENDOG敲除细胞中的过表达都影响了自噬流（图7d、e）。彗星试验结果也进一步证实了ENDOG核酸内切酶活性对诱导的DNA损伤反应和自噬至关重要。

先前的研究表明，caspase-8可裂解并激活Bid，而Bid介导ENDOG从线粒体转移到细胞质，最终转位到细胞核，导致染色质凝聚和DNA断裂。为了探究caspase-8/Bid是否与本研究情况有关，研究者进一步试验发现，caspase-8/Bid有助于线粒体释放ENDOG，可能进一步促进自噬。

图7