蛋白-蛋白间的相互作用是蛋白质发挥生物学功能的主要模式，蛋白质会通过结合不同的伙伴来行使不同的功能，形成复杂的信号转导网络。

常见的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀（Co-IP）、pull-down、酵母双杂交、荧光双分子互补（BiFC）、荧光共定位等。

pull-down技术将目标蛋白进行体外原核表达，使标签蛋白（GST或His等）与目标蛋白融合表达，借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来，可以不受抗体、物种限制，比较轻松的获得目标蛋白的结合蛋白，还可以通过外源同时表达目标蛋白和待测蛋白，确定它们是否发生直接的相互作用，或者确定两个蛋白结合的结构域，但该方法无法得知体内真实的结合情况。

实验大致步骤：GST融合蛋白的诱导表达→GST-诱饵蛋白和GST蛋白制备→GST-诱饵蛋白纯化→待测蛋白制备→GST pull-down→WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白。

1 GST融合蛋白的诱导表达

（1）将测序正确的“GST-目的基因”融合蛋白表达载体提取质粒，用大肠杆菌BL21感受态细胞进行转化。在1.5 mL EP管中加入200 µL含氨苄抗生素的LB培养基，挑取单克隆菌落接种到培养基中，置于37℃摇床上进行过夜培养； 

（2）取100 µL菌液以1:100的比例接入10 mL新配制的LB培养基中，然后置于37℃摇床上培养；

（3）1.5-2 h左右，检测菌液OD=600。当菌液的OD=600值达到0.4-0.6时，取100 µL菌液，12000 g离心1 min。弃去培养基，用40 µL的PBS将沉淀重悬，然后加入10 μL的5xloading buffer，开水煮10 min；

（4）向剩余的菌液加入5 μL 100 mM的IPTG，确保终浓度为0.05 mmol/L，置于220 rpm、16℃的恒温摇床诱导24 h左右。（IPTG诱导时间视目的蛋白情况而定）

2 GST-诱饵蛋白和GST蛋白制备 

（1）取已诱导表达可溶性GST-诱饵蛋白或GST蛋白的大肠杆菌菌液，4℃ 5000 g离心5 min，弃上清，收集大约50 μL菌体沉淀； 

（2）加入1 mL预冷的PBS，吹打混匀，4℃ 5000 g离心5 min，弃上清； 

（3）重复上步操作两次，共漂洗三次，尽量吸干液体； 

（4）将样本置于冰上，向菌体中加入500 μL预冷的裂解缓冲液（辉骏货号：FI8101）、5 μL蛋白酶抑制剂（辉骏货号：FI8105），吹打混匀，冰上超声破碎至溶液基本澄清；

（5）4℃ 12000 g离心15 min，收集上清至新的离心管中，取30 μL作为Bait-input，作为阳性对照，剩余用于pull-down实验，置于冰上备用或-80℃保存。

3 GST-诱饵蛋白纯化 

（1）将GST标签纯化树脂（辉骏货号：FI8304）颠倒混匀，实验组和对照组各取45 μL树脂到新的1.5 mL EP管中； 

（2）每组加入200 µL漂洗液（辉骏货号：FI8107），颠倒混匀30次，500 g离心5 min，弃上清； 

（3）重复上步操作一次； 

（4）向实验组树脂中加入表达GST-诱饵蛋白的大肠杆菌裂解液(或20 µg纯化好的GST-诱饵蛋白)，向对照组树脂中加入表达GST空载体的大肠杆菌裂解液(或20 µg纯化好的GST蛋白)，放混匀仪上4℃孵育1-2 h；  

（5）4℃ 500 g离心5 min，弃上清； 

（6）每组加入500 μL漂洗液，颠倒混匀30次，4℃ 500 g离心5 min，弃上清； 

（7）重复上步操作两次，共漂洗三次，得到纯化的GST-诱饵蛋白树脂。

4 待测蛋白制备 

（1）用预冷的PBS漂洗2-3次处理细胞样本，每次4℃ 500 g离心5 min，收集沉淀，尽量吸干液体；

(2) 将样本管置于冰上，每组加入300-500 μL预冷的裂解缓冲液、3-5 μL蛋白酶抑制剂（按1%添加），吹打混匀； 

(3) 冰上超声破碎至溶液基本澄清； 

(4) 4℃ 12000 g离心15 min，收集上清至新的离心管中；取30 μL作为Prey-input，将余下蛋白样本用于pull-down实验。

* 注意：①当样本不能完全裂解时（溶液很浑浊），可以增加裂解缓冲液或改善超声条件继续裂解。根据经验，样本蛋白浓度通常不低于3 μg/μL，总量约1-3 mg。 

②如果样本中目标蛋白丰度较低，或结合物间的结合较弱，可以增加初始样本量。

5 GST pull-down 

（1）向上步GST-诱饵蛋白树脂中加入待测样本裂解液，放混匀仪上室温孵育3 h或4℃孵育过夜；

（2）4℃ 500 g离心5 min，弃上清； 

（3）每组加入500 μL漂洗液，颠倒混匀30次，4℃ 500 g离心5 min，弃上清； 

（4）重复上步漂洗操作两次，共漂洗三次； 

（5）每组加入50 μL洗脱缓冲液（辉骏货号：FI8102），涡旋震荡20 s，放混匀仪上室温洗脱15 min； 

（6）涡旋震荡20 s，4℃ 12000 g离心5 min，收集上清至新的离心管中，-80℃保存，或直接用于Western Blot、SDS-PAGE或质谱实验。

6 WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白

6.1 WB检测是否存在靶蛋白

通过蛋白印迹(Western Blot)技术分别使用Anti-GST和Anti-prey对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够在pull-down中检测到prey蛋白，则说明这两种蛋白之间存在相互作用。

6.2 质谱鉴定洗脱液中的蛋白

通过质谱（MS）技术对洗脱液中的蛋白成分进行鉴定和分析，筛选诱饵蛋白的未知互作蛋白。辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析。