DNA pull down是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的经典技术。它通过特异性DNA序列捕获并鉴定与之结合的蛋白，尤其适用于寻找基因启动子区域的转录因子。

辉骏生物在本文将系统介绍DNA pulldown技术原理、实验流程、注意事项、结果解读、文献应用及常见问题与解决方案，为您提供清晰实用的实验参考。

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DNA pull down是体外条件下研究目标DNA片段与蛋白质相互作用的重要技术。其基本原理是先体外制备带有生物素标记的DNA探针；之后，生物素DNA探针结合到链霉亲和素磁珠上；再将DNA-Beads与细胞裂解液孵育，这样DNA结合蛋白便一起吸附在Beads上；洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将DNA结合蛋白从Beads洗脱下来，得到DNA pull down产物。

这种DNA-protein复合物既可以用Western Blot检测已知的结合蛋白，还可以采用质谱方法鉴定与目标DNA结合的未知蛋白。

图1 DNA pull-down实验原理图

1、质粒准备

构建含目的基因序列的质粒，这是后续实验的基础，为后续的 PCR 扩增提供模板，确保所研究的特定 DNA 序列能够被准确地扩增和操作，从而用于捕获与之相互作用的蛋白质。

注意：可同时构建突变体质粒（突变核心结合位点）作为阴性对照，排除非特异性结合干扰。

2、生物素标记的DNA探针制备

根据目标 DNA 序列设计并合成生物素标记的引物和未标记的引物，以目的基因质粒为模板，PCR 扩增分别得到生物素标记的 DNA 探针（实验组）和未标记的探针（对照组），用DNA凝胶回收试剂盒进行探针的回收纯化。

3、蛋白样本制备

3.1 总蛋白提取

(1)将两组样本（实验组+对照组）按照如下方法收集和处理：

图3 DNA pull-down实验分组图

3.2 核蛋白提取

如果提取核蛋白，需要自备核蛋白提取试剂盒，并按照说明书操作。提取好的核蛋白取 30 μL 作为 input，剩余平分为两份用于 DNA pull-down 实验（记为实验组和对照组），置于冰上备用或- 80℃保存。

注意：提取核蛋白所需的样本量约为总蛋白的两倍，但具体使用量还需要根据实际操作来摸索；根据经验，样本总蛋白浓度通常不低于 5 μg/μL，总量约 2~3 mg。

4、DNA pull-down

1. 3 μg 探针 + 链霉亲和素磁珠（辉骏货号 FI8303），室温混 30 min。  

2. 磁力架 1 min，弃上清。  

3. 500 μL 漂洗液颠倒 30 次，磁力架 1 min，弃液；再洗 1 次。  

4. 加对应裂解液，4 ℃混 2–4 h。  

5. 磁力架 1 min，弃上清。

5、洗涤

(1) 每组加入 500 μL 漂洗液，颠倒混匀 30 次，放磁力架上静置 1 min 并弃上清；

(2) 重复上步操作两次，共漂洗三次，保留磁珠。

6、洗脱

6.1 非变性洗脱法

磁珠加50 µL洗脱液，涡旋20 s，室温10–15 min，再涡旋20 s；1000 g 20 s，磁力架1 min，取上清，–80 ℃存，保持活性，可直接用于质谱、WB等。

6.2 SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱法（变性洗脱法）

向磁珠中加入 50 μL 1×SDS-PAGE 上样缓冲液，95 ℃加热5 min；磁力架上静置 1 min，收集上清至新的离心管中。该洗脱产物适用于 SDS-PAGE 或 Western Blot 检测；如果需要进行质谱检测，则切胶条后送检。

注意：根据实验需求，可选择非变性洗脱法或变性洗脱法进行洗脱；由于DNA pulldown 捕获的蛋白量通常较少，建议将SDS-PAGE 胶用硝酸银染色。

7、WB检测是否存在靶蛋白/质谱检测洗脱液中的蛋白

PS：辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析

1.  DNA探针需经电泳验证完整性。

2.  细胞或组织裂解应充分、均匀，以保证蛋白完整与活性。

3.  洗涤步骤应适度，避免过度洗脱特异性结合蛋白。

4.  选择适宜的蛋白分析方法，以确保结合蛋白的准确鉴定与定量。

实验目标：筛选与目标 DNA 序列结合的蛋白质

(1) 未标记组：未标记目标 DNA 探针的 pull-down 产物（对照组）；

(2) 标记组：生物素标记目标 DNA 探针的 pull-down 产物（实验组）。

图5 DNA pull-down蛋白银染图

辉骏生物技术服务优势‌：

• 一站式：探针设计→pull down→LC-MS/MS→生信分析，全程自建平台。

• 高灵敏：10⁻¹² mol 级蛋白检出率＞95%，微量样本（≥30 μg）即可开工。

• 低背景：专利封闭磁珠（货号 FI8303）+ 严苛漂洗体系，非特异 <5%

• ‌文献级成果‌：众多DNA pulldown客户服务案例发表于高影响力期刊，助力疾病机制研究。

  
  

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