circRNA pull down技术多依赖接口序列设计探针捕获circRNA及结合蛋白，但受限于序列特征，多数circRNA难以设计理想探针，易致实验失败。辉骏生物研发新型circRNA pull down方法（已获国家发明专利授权），通过构建circRNA过表达载体，为circRNA连接16nt短RNA序列标签F2，该标签与其特异性配体亲和力强，可高效调取靶RNA及结合蛋白。后续可借助western blot、LC-MS/MS检测结合蛋白，通过qPCR检测结合靶circRNA的miRNA。

图：circRNA pull down发明专利证书—辉骏生物

辉骏生物在本文将围绕circRNA pull-down技术原理、流程、注意事项、结果解读、文献应用及常见问题与解决方案展开详解，技术咨询或产品订购可随时联系。

circRNA pull down实验原理

通过将 F2 标签序列与目标 circRNA 序列连接，构建成 F2-circRNA 过表达载体，转染并裂解目的细胞，之后采用特异性配体磁珠来调取 F2-circRNA 及其结合蛋白或结合 RNA。去除未结合的物质后，洗脱下来的蛋白质可通过western blot或LC-MS/MS检测，或提取 RNA 进行qPCR检测。

circRNA pull down实验步骤及结果

1 F2-circRNA 过表达细胞制备

(1) 将 F2 标签序列（GGCGCTGACAAAGCGCC）分为两部分，分别连在 circRNA 接口处首尾（例如AAAGCGCC 连在 circRNA 头部，GGCGCTGAC 连在 circRNA 尾部），并将此序列构建至 circRNA 表达载体中，只有当载体上的 circRNA 在细胞内首尾连接成环后，才能在接口处形成完整的 F2 标签，避免了线性序列的干扰。

(2) 表达载体转染目的细胞，细胞内会天然转录得到带 F2 标签的目标 circRNA（对照组用空载体表达细胞）。

(3) qPCR 检测 F2-circRNA 的表达情况。

2 样本裂解

(1) 实验组和对照组各取 2*10e7个细胞，用预冷的 PBS（RNase-free）清洗细胞 2~3 次，每次 4°C 500 g 离心5 min 收集细胞沉淀，彻底去除培养基成分；

(2) 将样本置于冰上，每组加入 500 μL 预冷的裂解缓冲液（辉骏货号：FI8101）、5 μL 蛋白酶抑制剂（辉骏货号：FI8105）和 2.5 μL RNA 酶抑制剂（辉骏货号：FI8106），吹打混匀；

(3) 为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清；如果无超声条件，可置于冰上裂解 30 min，期间每 10 min涡旋混匀一次，每次 5 s；

(4) 4℃ 12000 g 离心 15 min，收集上清至新的离心管中；

(5) 取 30 μL 作为 input，剩余置于冰上备用或- 80℃保存。

图3 circRNA pull-down实验分组图

(1) 将磁珠上下颠倒混匀，取实验组和对照组一共所需的 80 μL 磁珠到新的离心管中；

4 circRNA pull-down

(1) 将制备好的细胞裂解液加入相应组别的磁珠中，混匀仪上 4°C 孵育 2~4 h；

(2) 放磁力架上静置 1 min 并弃上清；

(3) 每组加入 500 μL 漂洗液（步骤 3 准备），颠倒混匀 30 次，放磁力架上静置 1 min 并弃上清；

(4) 重复上步操作两次，共漂洗三次，保留磁珠。

5 蛋白洗脱

如果需要对 pull down 产物进行蛋白检测，可以在以下方案中选择合适的洗脱方法。

5.1 非变性洗脱 

向磁珠中加入50 µL洗脱缓冲液（辉骏货号为：FI8102），涡旋振荡20 s，放混匀仪上室温洗脱10-15 min；涡旋振荡20 s，1000 g离心20 s；放磁力架上静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，-80℃保存。该洗脱产物保持原有的生物活性，适用于后期各种检测，例如质谱、SDS-PAGE 或 Western-blot 等。

5.2 变性洗脱

注意：RNA pull-down捕获的蛋白量通常较少，因此SDS-PAGE胶建议用硝酸银染色，检测富集蛋白的情况。

联系技术支持

18927549347、13430303037

结果解读

实验目标：检测细胞中的目标 circRNA 与待测蛋白（Prey）是否存在相互作用。

(1) Input_NC：空载对照组细胞的裂解液；

(2) Input_F2-cirRNA：过表达 F2-circRNA 细胞的裂解液；

(3) circRNA pull-down_NC：空载对照组细胞的 circRNA pull-down 产物；

(4) circRNA pull-down_F2-cirRNA：过表达 F2-circRNA 细胞的 circRNA pull-down 产物。

6. RNA 提取纯化

如果需要对 pull down 产物进行 RNA 检测，可以购买微量 RNA 提取试剂盒或按照以下步骤提取 RNA。

(1) 向磁珠中加入 1 mL Trizol，室温静置 5 min，4 ℃ 12000 g 离心 10 min，取上清；

(2) 加入 0.2 mL 氯仿，涡旋混匀或猛烈晃动 15 s，室温放置 2~3 min；

(3) 4 ℃ 12000 g 离心 15 min，吸取水相至新的无 RNase 离心管中（约可吸取 0.5-0.55 mL）；

(4) 加入 0.5 mL 异丙醇，颠倒数次混匀，室温下沉淀 10 min 或 -20 ℃ 沉淀过夜；

(5) 4 ℃ 12000 g 离心 10 min，管底可见 RNA 沉淀，弃上清；

(6) 加入 1 mL 75%乙醇（DEPC 水或 RNase-free 水配制）；

(7) 4℃ 12000 g 离心 10 min，弃上清；5000 g 快速离心 1 s，小心吸尽液体；

(8) 待 RNA 略干后，加入 20 μL DEPC 水或 RNase-free 水溶解，- 80 ℃保存或直接进行反转录。

注意：RIP 后的 RNA 一般较微量，操作时注意勿把 RNA 沉淀吸走；切勿让 RNA 过分干燥，否则将极难溶解，且测出的 A260/280 值会低于 1.6。

Q：获得的蛋白复合产物少？

A：①可能是样本蛋白量不够，可提高样本用量；

②可能是孵育时间不够，延长孵育时间(如孵育过夜)，但需要注意孵育时间过长也可能会导致非特异性结合增多。

Q：如何减少非特异性蛋白的结合？获得的复合物杂蛋白多

A：可能是非特异性的蛋白结合在磁珠上，可通过增加漂洗时间和次数，或将样本进行预处理：先与磁珠孵育，去除非特异结合蛋白。

在2025年Molecular neurobiology杂志上发表了一篇关于关于整合素连接激酶（ILK）在脑缺血再灌注损伤（CIRI）所引发的神经元凋亡过程中的作用研究的文章，作者使用了辉骏生物circRNA Pull-Down 试剂盒（货号：FI8710），利用F2标签对circ0000964进行了标记，circRNA Pull-Down 实验来分析circ0000964、miR-758-3p 和 ILK 在大鼠大脑皮质神经元中的相互作用。

作者探究靶circ0000964是否通过互作的RNA（miR-758-3p ）调控ILK表达，通过富集的circ0000964和 miR-758-3p 的水平升高，表明它们之间存在直接相互作用（图C、D）。此外，mRNA 分析显示，circ0000964与 miR-758-3p 的水平呈负相关，这反过来又影响了 ILK 的表达（图 E）。

辉骏生物circRNA pull down实验服务内容

1、circRNA pull-down WB（验证型）

客户提供

1.实验样本；

2.circRNA序列的质粒模板；

3.待测蛋白抗体；

4.实验信息表。

我们提供

1. circRNA-F2载体构建和成环检测，包括载体质粒及测序结果、qPCR检测结果、构建和检测详细报告；

2. circRNA-F2质粒转染目的细胞和表达效率检测，即qPCR的检测结果；

3. circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白，包括circRNA的qPCR检测结果、待测蛋白的Western blot检测图、Pull down实验报告。

2、circRNA pull-down MS（筛选型）

客户提供

1. 实验样本；

2. circRNA序列的质粒模板；

3. 实验信息表。

我们提供

1. circRNA-F2载体构建和成环检测，包括载体质粒及测序结果、qPCR检测结果、构建和检测详细报告；

2. circRNA-F2质粒转染目的细胞和表达效率检测，即qPCR检测结果；

3. circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白，包括circRNA的qPCR检测结果、蛋白SDS-PAGE银染检测图、Pull down实验报告；

4. LC-MS/MS检测和数据分析，包括质谱检测结果及报告、互作蛋白筛选表格、生物信息学分析结果和报告。

辉骏生物10多年RNA和蛋白研究经验，已掌握先进的 circRNA pull-down 技术，帮助您识别 miRNA/RBP 和 circRNA 之间的相互作用。每个项目都是完全定制的，以满足您的科学需求，经验丰富的团队可以为您提供灵活的解决方案，以更快的时间和更低的价格给您最可靠的服务。此外，我们还提供circRNA pulldown试剂盒，操作简便，价格低，众多客户使用后已高效完成circRNA pull down实验！

售后技术支持将一直保持到文章发表，确保您安心进行下游实验及投稿。如果您对circRNA pull-down有任何实验问题，可与辉骏联系：4006991663！