蛋白质鉴定方法

蛋白质鉴定这里的是指利用一定的生化和物理方法对蛋白质进行准确的筛选和鉴定。 传统的蛋白质鉴定方法，包括免疫印迹、已知或未知蛋白质的复合分析以及内肽的化学测序，都复杂、耗时且准确度较低。

蛋白质鉴定方法已经从图像分析技术、微量测序、氨基酸组成分析发展到质谱分析。  图像分析技术使用光谱仪。  整个过程涉及到一些斑点的检测、背景扣除、斑点匹配和数据库的构建。  图像分析和氨基酸组成分析需要结合其他蛋白质鉴定技术来完成整个过程。  微测序技术更新迅速，实现了蛋白质自动识别的目标。   如今，研究人员越来越倾向于选择质谱相关技术进行快速蛋白质鉴定。

质谱鉴定蛋白质的不同方法

质谱仪可以将肽指纹和肽片段的测序结果与蛋白质数据库中蛋白质的理论肽质量指纹（PMF）进行比较，以寻找最佳候选蛋白质。  与质谱相关的蛋白质鉴定方法包括基于 MALDI-TOF 的蛋白质指纹识别和基于 LC-MS/MS 的肽测序。

• MALDI-TOF / MS

(1) MALDI-TOF/MS的原理

MALDI-TOF 是一种基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪。  基于 MALDI-TOF 的蛋白质指纹图谱法用于用某种蛋白水解酶（通常是胰蛋白酶）消化样品并获得 MS 谱，从而生成所有肽（或 MH+）的质量。   这些质量用作指纹以在数据库中搜索蛋白质并匹配测量的质量。  与最高分匹配的蛋白质为候选蛋白质。

图 1. MALDI-TOF 质谱分析过程

(2) MALDI-TOF/MS的优势

MALDI-TOF/MS 的优势在于高精度的离子反射器和延迟离子提取，这使得它可以快速收集 MALDI-TOF/MS 数据并分析结果。

(3) MALDI-TOF/MS的应用

主要用于临床医学、食品工业和动植物检疫中微生物的鉴定和分类。

• 液相色谱-质谱/质谱

(1) LC-MS/MS的原理

高效液相色谱-质谱联用系统可以通过分析物质的分子量和元素组成来研究分子结构等信息。  在通过 LC-MS/MS 肽测序鉴定蛋白质期间，蛋白水解消化（通常是胰蛋白酶消化）中的肽混合物通过 HPLC 进行分离。  串联质谱仪和 HPLC 用于进行肽片段化。  获得每个碎片肽段的 MS/MS 谱图（通常每个样品有数千个 MS/MS 谱图）。  每个 MS/MS 谱图（对应于特定的肽段序列）用于搜索蛋白质数据库中的匹配肽段，以最终识别蛋白质。   尤其是反相液相色谱和串联质谱（串联质谱）的结合，可以在几十皮摩尔的水平上进行检测。   如果毛细管色谱与串联质谱相结合，可以检测到低浓度、低于飞摩尔水平和原子水平的蛋白质。   目前，蛋白质的鉴定多采用酶水解、液相色谱分离、串联质谱和计算机算法相结合的方法。

图 2. 与液相色谱 (LC-MS/MS) 相关的串联质谱图

(2) LC-MS/MS的优势

LC-MS/MS 可以以高灵敏度和特异性分析中小极性分子。

(3) LC-MS/MS的应用

LC-MS/MS 可以确定蛋白质分子量，分析肽段和蛋白质修饰位点，并鉴定蛋白质。  可用于生物化学、农业和临床医学等领域。

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