中文标题：HOXD9-介导的PAXIP1-AS1通过PABPC1/PAK1调控胃癌的进展

发表期刊：Cell Death Dis

中科院分区：1区

影响因子：9.685

发表时间：2023年5月

合作单位：南方医科大学南方医院

运用技术：RNA pull down MS、RNA免疫沉淀（RIP）、染色质免疫沉淀（CHIP）、LC-MS/MS质谱检测（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景：

胃癌（GC）患者的预后五年生存率不到25%，高死亡率归因于诊断不及时、临床表现延迟和侵袭转移率高，因此需要更好地了解GC进展和转移的分子机制，据报道，PAXIP1-AS1与癌症的发生有关，然而对其在GC中的作用仍知之甚少。本研究探索了HOXD9/PAXIP1-AS1/PAPPC1/PAK1信号轴在GC转移中的重要性，为GC诊断标志物和治疗靶点的开发提供了新思路。

● 研究结果

1、PAXIP1-AS1受到HOXD9的转录抑制

先前的研究已经发现转录因子HOXD9促进胃肠癌EMT诱导的转移，因此本项目首先采用WB实验验证了HOXD9蛋白在GC细胞系中的表达，其在AGS、NCI-N87、SNU-719、MKN-45、HGC-27、BGC-823、MGC803和SGC-7901细胞系中的表达水平显著高于GES-1细胞系（胃黏膜上皮细胞），而在MKN-74、SNU-1和SNU-5中表达较低（图1A）。HOXD9过表达细胞的RNA测序和HGNC数据库分析确定并注释了14个差异表达的lncRNA（图1B），TCGA数据库发现低表达PAXIP1-AS1的GC患者的总生存期较短，因此选择PAXIP1-AS1做进一步研究。HOXD9的过表达（图1C1）或敲低（图1C2）证实了HOXD9与PAXIP1-AS1的表达呈负相关。

接着，软件预测发现HOXD9在PAXIP1-AS1启动子区有两个结合位点（图1D，E），接着分别使用HOXD9抗体和正常兔IgG对GC细胞进行染色质免疫共沉淀技术（ChIP）分析，PCR结果表明HOXD9蛋白只与第二预测位点（−1503 to −1513）结合（图1F）。双荧光素酶报告基因实验表明，第二结合位点对于HOXD9抑制PAXIP1-AS1至关重要（图1G）。这些实验结果表明HOXD9与特定的PAXIP1-AS1启动子结合以抑制其转录。

图1

2、PAXIP1-AS1抑制GC进展

GEPIA数据库分析显示，与正常组（n=211）相比，GC组（n=408）组织中PAXIP1AS1的表达较低（图1A），qPCR实验技术检测了PAXIP1-AS1在75对匹配的正常和癌性胃组织中的表达，结果表明PAXIP1-AS在GC中显著下调（图2B，C）。此外，PAXIP1-AS1在除BGC-823外的大多数GC细胞系中的表达下调（图2D），且与HOXD9的表达呈负相关（图1A）。为了确定PAXIP1-AS1在GC细胞中的亚细胞定位，对GES-1和MKN-74细胞进行细胞质/核分离，发现PAXIP1-AS1在细胞质中的表达高于细胞核（图2E），原位杂交（ISH）对10对正常和GC组织的研究得到了一致的结果（2F）。GC组织样本中PAXIP1-AS的检测结果表明，PAXIP1-AS1的表达与肿瘤侵袭显著相关（图2G、H），这些发现表明PAXIP1-AS1在GC进展中作为肿瘤抑制因子起作用。

图2

3、PAXIP1-AS1在体外和体内抑制GC细胞的生长、迁移和侵袭

为了评估PAXIP1-AS对体外细胞功能的影响，首先在AGS和MKN-45细胞中转染PAXIP1-AS1质粒过表达PAXIP1-AS1，在MKN-74细胞中转染siRNA敲低PAXIP1-AS1。EdU荧光染色对细胞增殖率的测定结果表明，PAXIP1-AS1过表达组中的阳性细胞平均百分比显著降低（图3A），敲低组则相反（图3B）。克隆形成实验进一步证明，过表达或敲低PAXIP1-AS1分别导致GC细胞增殖减少或增加（图3C,D）。Transwell实验发现PAXIP1-AS1敲除细胞有更高的迁移和侵袭活性（图3G–J）。细胞划痕结果显示PAXIP1-AS1过表达导致伤口闭合显著减慢，反之亦然（图3K,L）。

为了研究PAXIP1-AS1对体内肿瘤生长的影响，将PAXIP1-AS1过表达的MKN-74细胞和对照细胞注射到小鼠体内建立皮下异种移植模型，结果显示 PAXIP1-AS1过表达组的肿瘤体积更小，肿瘤增殖率也显著降低（图3F）。接着，研究者将PAXIP1-AS1过表达细胞和对照细胞注射到裸鼠尾静脉，建立尾静脉-肺转移模型（图3M），发现PAXIP1-AS1过表达细胞在肺中形成的转移结节更少（图4I），IHC实验确定了EMT标记物E-钙粘蛋白和MMP2的表达情况：E-钙粘蛋白在癌组织中表达较低，MMP2则较高。将PAXIP1-AS1过表达细胞和对照细胞分别注射到小鼠脾脏中建立脾内肝转移模型，三周后解剖肝脏，发现 PAXIP1-AS1组中观察到的转移瘤比对照更少（图3N,O）。

这些研究结果表明PAXIP1-AS1的过表达能抑制肿瘤的增殖和转移。

图3

4、PAXIP1-AS1过表达显著抑制了HOXD9诱导的胃癌细胞EMT和侵袭转移

先前多个研究已报道HOXD9通过EMT改变促进肿瘤转移，因此本研究进一步探讨了PAXIP1-AS1是否参与HOXD9介导的肿瘤细胞迁移、侵袭和EMT。当过表达HOXD9后（图4A），细胞呈现EMT特征，即纺锤状的成纤维细胞形态，而共转染HOXD9和PAXIP1-AS1会导致EMT的逆转（图4B）。采用鬼笔环肽染色F-actin发现，与单独表达HOXD9相比，同时过表达HOXD9和PAXIP1-AS1会导致粗的F-actin蛋白丝部分解聚（图4C），这与EMT诱导的表型相反。

HOXD9过表达导致MMP2和Vimentin上调， E-cadherin下调；与之相比，同时过表达HOXD9和PAXIP1-AS1的细胞中的MMP2和Vimentin表达降低，E-cadherin表达增加（图4D）。Transwell技术实验和细胞划痕技术实验表明， HOXD9过表达增加了GC细胞的侵袭和迁移潜力，同时过表达HOXD9和PAXIP1-AS1逆转了这一现象（图4E-G）。这些实验结果表明HOXD9-PAXIP1-AS1信号通路调控GC细胞的EMT、迁移和侵袭。

图4

5、GC细胞中的PAXIP1-AS1与PABPC1蛋白相互作用

研究者通过RNA pull down技术和质谱(MS)方法鉴定了312个PAXIP1-AS1的潜在结合蛋白（图5A），其中参与多基因3′UTR调控的PABPC1蛋白引起了他们的注意。RNA pull down和WB检测表明PAXIP1-AS1可以与PABPC1结合（图5B），RNA免疫沉淀（RIP）技术实验也再次确认了它们间的相互作用（图5C）。接着，研究人员采用一系列PAXIP1-AS1突变体（图5D）来进行RNA pull down WB实验，最终确定PAXIP1-AS1的F1–F4区域与PABPC1蛋白结合。此外，构建带His标签的PABPC1全长及五个缺失突变体（图5F）进行RIP qPCR实验，发现PAXIP1-AS1主要与PABPC1中的RRM4和PABC结构域结合（图5G）。

那么PAXIP1-AS1与PABCS1的结合是否影响其蛋白的稳定性呢？研究发现PAXIP1-AS1过表达导致PABPC1蛋白质水平减少，但其mRNA水平未受影响（图5H、I）。蛋白稳定性测定发现PAXIP1-AS1过表达促进了PABPC1蛋白的降解（图5J）。蛋白酶体抑制剂MG132显著减弱了PAXIP1-AS1过表达导致的PABPC1蛋白降解(图5K)。泛素化实验证实PAXIP1-AS1促进了PABPC1的泛素化(图5L)。这些结果表明，PAXIP1-AS1可以直接与PABPC1蛋白结合，并通过泛素化促进其降解，从而调节其表达。

图5

6、PAXIP1-AS1与PABPC1相互作用以调控GC细胞的转移

研究者继续调查了PAXIP1-AS1和PABPC1之间的相互作用是否具有功能。在体外GC细胞中，PAXIP1-AS1过表达增加了上皮标志物(E-cadherin)的表达，同时降低了间充质标志物（Vimentin和MMP2）的表达，降低了细胞迁移的数量和速率；PAXIP1-AS1和PABPC1共转染逆转了PAXIP1-AS1对GC细胞中EMT、细胞侵袭和迁移的抑制作用（图6A–D）。此外，构建多个慢病毒感染细胞系并分别注射到裸鼠尾静脉中（图6E），结果发现静脉接种PAXIP1-AS1细胞导致小鼠肺部可见肿瘤数量显著减少，这与转移基因座数量减少有关。相反，接种PAXIP1-AS1+PABPC1细胞则观察到转移基因座数量的增加（图6F）。抗E-cadherin和MMP2蛋白的IHC染色进一步证实了裸鼠肺中GC转移的存在（图6G，H）。PAXIP1-AS1过表达组的肝脏转移瘤更少，而PAXIP1-AS1+PAPPC1组逆转了这一效果（图6I、J）。这些数据表明PAXIP1-AS1与PABPC1协同调节GC细胞迁移和EMT。

图6

7、PABPC1通过增强PAK1 mRNA的稳定性促进胃癌转移

由于PABPC1常结合mRNA来起调控作用，因此研究者使用AURA数据库预测了PABPC1的结合基序（图7A）并确定了PAPC1可能结合的mRNA。使用siRNA敲低PABPC1，qPCR检测发现PAK1 mRNA的变化最显著（图7B）。放线菌素D阻断mRNA合成后，PABPC1干扰细胞的PAK1 mRNA半衰期更短，表明PABPC1在转录后水平上增强了PAK1 mRNA的稳定性（图7C）。RIP qPCR实验发现PAK1 mRNA在PABPC1-RNA结合复合物中有较高富集（图7D）。野生型PAK1 3′UTR和突变型PAK1 3′UTR（突变PABPC1结合位点）的双荧光素酶实验结果表明，PABPC1可以与PAK1 3′UTR结合，从而提高其稳定性（图7E-F）。在PABPC1过表达细胞中干扰PAK1，可以通过EMT抑制PABPC1诱导的GC侵袭和转移（图7G–L）。WB技术检测了PAXIP1-AS1、PABPC1和PAK1表达之间的关系，结果显示PAXIP1-AS上调显著降低了PAK1的表达（图7M），表明PAXIP1-AS1参与调控GC细胞中PABPC1和PAK1的表达。

这些结果表明，PABPC1通过增强GC细胞中PAK1 mRNA的稳定性来促进转移和EMT。

图7

8、人类胃样本中PAXIP1-AS1的表达与HOXD9、PABPC1和PAK1的表达呈负相关

使用siRNA敲低HOXD9的表达后，PABPC1和PAK1的表达也显著降低了（图8A）。肿瘤样本中HOXD9、PABPC1和PAK1通常上调，而PAXIP1-AS1经常下调（图8B，C）。Pearson相关分析显示，GC组织中PAXIP1-AS1和HOXD9（图8D）、PAXIP1 AS1和PABPC1（图8G），以及PAXIP1-AS1和PAK1（图8H）呈负相关，而PABPC1和HOXD9之间的正相关性（图8E），PAK1和HOXD9（图8F），以及PAK1和PABPC1（图8I）呈正相关。IHC和ISH结果显示，GC中HOXD9、PABPC1和PAK1的表达显著较高，而PAXIP1-AS1的表达显著较低（图8J）。这些结果表明，在GC样品中，PAXIP1-AS1的表达与HOXD9、PABPC1和PAK1的表达呈负相关。

图8

RNA pull down技术实验—辉骏服务内容

RNA pull down实验外包样本要求

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